CD147和基质金属蛋白酶9在三阴性乳腺癌新辅助化疗前的表达及指导意义Δ

张 静，姚淑晖，王小红

(唐山市人民医院放化疗科，河北 唐山 063000)

三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的特征是其肿瘤细胞不表达雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕酮受体(progesterone receptor，PR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)，其患者数占乳腺癌总患者数的15%～25%。基因表达谱分析结果表明，大部分TNBC具有基底样细胞的分子表型[1]。TNBC与生殖系统相关的BRCA1基因突变肿瘤的分子表达谱存在显著重叠，提示TNBC与BRCA1基因突变相关的乳腺癌存在相同的致癌分子机制[2]。此外，TNBC在组织学分级上表现为低分化、高级别的肿瘤，且在年轻女性和绝经前女性中的发病率越来越高。由于缺乏治疗靶点，TNBC患者不能从常规的内分泌靶向治疗、抗HER-2药物或一些其他类型的化学疗法中受益。目前尚无治疗TNBC的标准方案，TNBC患者的死亡率也相对较高[3]。近期研究结果表明，CD147和基质金属蛋白酶9(MMP-9)在TNBC中可能发挥重要作用。CD147可以作为肿瘤细胞相关的细胞外基质金属蛋白酶诱导分子，通过肿瘤-基质的相互作用调控基质金属蛋白酶的表达[4]。CD147是一类免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在多种肿瘤细胞中过表达，并与肿瘤侵袭、转移和血管生成相关[5]。MMP-9是一类分泌型多结构域酶，可由多种类型细胞产生，包括角质形成细胞、单核细胞、巨噬细胞、多形核白细胞和多种恶性肿瘤细胞。与非侵袭性肿瘤相比，侵袭性肿瘤中MMP-9的表达水平和活性都显著升高[6]。CD147和MMP-9在多种恶性肿瘤的转移中起着重要作用[7]，但尚不清楚其在TNBC中的表达及其临床意义。本研究检测了TNBC患者中CD147和MMP-9的表达水平，分析其与患者临床特征、预后的相关性，探讨其成为TNBC诊断和预后生物标志物的可能性。

1 资料与方法

1.1 研究设计

本研究募集了2017年2月至2019年2月127例TNBC患者，均为女性患者，平均年龄59岁(范围45～68岁)，并获得了一整套随访数据。所有TNBC患者均在术前接受了多柔比星联合环磷酰胺的新辅助化疗，3周1次，共治疗4个周期。随后接受根治性乳房切除术或保守性腋窝淋巴结清扫术。根据肿瘤的状态，每例患者在术后接受合适的辅助治疗。所有肿瘤均在组织病理学上得到证实，并进行TNM分期。涉及人类参与者和人体样本的所有研究均已获得医院伦理与科学委员会的批准，所有参与者均签署了机构审查委员会批准的知情同意书，以参与本研究。

1.2 检测指标

采用甲醛固定和石蜡包埋的切片进行免疫组织化学测定。组织切片(厚度为4 μm)在二甲苯中脱蜡，并在梯度乙醇中水化。抗生物素蛋白-生物素复合物方法用于免疫组化。使用高压修复法，在1×EDTA缓冲液中进行抗原修复20 min。3%过氧化氢的甲醇溶液封闭内源过氧化物酶20 min。使用5%的牛血清白蛋白进行封闭(1 h)。然后将载玻片与抗人CD147(1∶50稀释，北京中杉金桥生物技术有限公司)或MMP-9抗体(1∶100稀释，北京中杉金桥生物技术有限公司)的兔多克隆抗体在室温(25 ℃)下孵育1 h，然后在室温下孵育辣根过氧化物酶标记的二抗反应1 h。采用DAB染色后用苏木精复染。具有膜或细胞质染色的肿瘤细胞被认为是CD147或MMP-9表达阳性。采用Image-Pro Plus 6.0软件分析切片中CD147和MMP-9阳性信号，每张切片随机选择5个视野(×200)的数字图像，使用5个视野的光密度平均值作为CD147和MMP-9的表达强度。免疫组织化学染色的组织切片由2名组织病理学家单盲分别评分。染色强度根据0～3分进行分级，分别为阴性(0分)、弱(1分)、中等(2分)或强(3分)。阳性程度定义为阳性染色的恶性肿瘤细胞或纤维组织细胞区域相对于整个组织区域的百分比，以0～4分进行分级：0分，<10%；1分，10%～25%；2分，>25%～50%；3分，>50%～75%；4分，>75%。染色强度和染色程度评分的总和作为CD147和MMP-9的最终染色评分(0～7分)。对于统计分析，0～5和6～7分的总染色评分分别被认为是低表达和高表达。

1.3 统计学方法

所有统计学分析均采用SPSS 18.0软件进行。采用Pearson相关性分析检测CD147与MMP-9表达水平之间的相关性。双侧卡方检验和Fisher精确检验用于比较低表达组和高表达组之间的临床病理学参数。根据Kaplan-Meier方法计算存活曲线。已知与乳腺癌预后相关的临床病理因素，如腋窝淋巴结转移(阳性与阴性)、肿瘤组织学分级(3级与1—2级)、肿瘤大小(> 2 cm与≤2 cm)、化疗方案(紫杉烷类、蒽环类药物及蒽环类+紫杉烷类)、绝经状态(绝经前与绝经后)以及CD147(高与低)和MMP-9(高与低)的表达，通过单变量分析进行检测，然后将在单变量分析中发现的重要变量纳入多变量Cox比例风险回归模型，从而找到预后的独立危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的临床特征

127例TNBC患者新辅助化疗前的临床特征见表1。其中，CD147高表达患者占48.0%(61/127)，MMP-9高表达患者占53.5%(68/127)。新辅助化疗前，TNBC组织中CD147与MMP-9表达呈显著正相关(n=127，r=0.609，P<0.01)，见图1。

表1 新辅助化疗前患者的临床特征及化疗方案Tab 1 Clinical characteristics and chemotherapy regimen of patients before neoadjuvant chemotherapy

注：χ2、P分别为CD147高表达患者、MMP-9高表达患者与所有患者的比较结果

Note：χ2andPare the comparison results of patients with high CD147 expression and patients with high mmp-9 expression with all patients, respectively

图1 新辅助化疗前TNBC患者乳腺肿瘤组织中CD147和MMP-9表达相关性Fig 1 Correlation between expression of CD147 and MMP-9 in breast tumor tissues of TNBC patients before neoadjuvant chemotherapy

2.2 CD147和MMP-9与临床病理特征的相关性分析

2.3 CD147和MMP-9与患者预后的相关性分析

进一步评估CD147和MMP-9对所有患者生存率的预后价值。所有患者均接受术后化疗和X线放射治疗。Kaplan-Meier分析结果显示，具有高表达水平的CD147和MMP-9的TNBC患者的生存率明显低于具有低表达水平的CD147和MMP-9的TNBC患者(PCD147=0.039，中位时间为36.3个月 vs. 46.7个月；PMMP-9=0.037，中位时间为34.9个月 vs. 47.4个月)，见图2。多变量分析结果表明，除肿瘤大小、肿瘤分级和淋巴结状态外， CD147和MMP-9都是TNBC患者不良预后的独立危险因素(PCD147=0.023；PMMP-9=0.015)，见表2。结果表明，CD147/MMP-9的表达增加与TNBC患者治疗失败显著相关。

A.CD147；B.MMP-9A.CD147；B.MMP-9图2 CD147和MMP-9与TNBC患者预后的相关性Fig 2 Correlation between CD147 and MMP-9 and prognosis in patients with TNBC

参数危险比P95%CI肿瘤大小>2 cm1.7330.031.054～2.848淋巴结转移3.09001.798～5.311肿瘤分级1.8580.011.157～2.984CD147高表达2.8670.0231.159～7.093MMP-9高表达1.8240.0151.122～2.965

3 讨论

最近的统计数据显示，2012年美国预计新发乳腺癌患者数和病死患者数分别居女性恶性肿瘤的第1和第2位，估计有226 870例新诊断的患者和39 510例死亡患者[8]。从组织病理学和分子学角度来看，TNBC的表型是异质的，表明其存在不同的分子亚型。因此，亟需鉴定TNBC患者的分子预测指标，这对于TNBC的临床治疗具有指导意义。本研究在127例TNBC患者中检测了CD147和MMP-9的表达，并发现CD147和MMP-9的表达可能是TNBC的预测因素。

CD147是在肿瘤细胞表面上表达的黏附分子，在多种恶性肿瘤细胞的表面上过表达。目前认为CD147是肿瘤细胞相关的细胞外基质金属蛋白酶诱导剂，在肿瘤的恶性转化、侵袭、转移和血管生成中起着重要作用[9]。而CD147过表达与基质金属蛋白酶蛋白在恶性肿瘤的侵袭和转移中的高表达和分泌有关[10]。将CD147的反义RNA转染到肝细胞癌细胞中，可降低MMP-9的分泌，并抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[11]。原发性乳腺癌组织中，CD147的表达与肿瘤大小和分期相关，可作为患者预后不良的指标[12]。MMP-9的主要功能是调控细胞基质，切割变性胶原(明胶)和4型胶原，后两者是基底膜的主要成分[13]。MMP-9的降解作用有助于肿瘤细胞进入血液和淋巴循环，导致肿瘤转移。TNBC和涎腺导管癌都属于高度侵袭性的腺癌[14]，这2种肿瘤之间可能存在相同的临床特征和生物学行为。CD147与MMP-9表达之间的正相关性表明CD147参与TNBC中MMP-9的调节。

本研究首次检测了TNBC患者中CD147和MMP-9的表达水平并确定其与TNBC预后的相关性，但也存在一些限制和不足。首先，本研究纳入的患者数量相对较少，且是一项回顾性研究。此外，未在远处转移部位分析上述标志物的表达状态，即没有在疾病进展的相对“活跃”部位检测有关标志物的表达。本研究结果表明，TNBC患者的生存和预后可能依赖于CD147和MMP-9的表达以及其他临床因素，如诊断时的淋巴结转移阶段。

综上所述， CD147和MMP-9的高表达状态可以预测TNBC患者的不良预后。