伤科黄水对大鼠灌胃给药的安全性研究Δ

蒋春飞，刘东文，郑芳昊

(佛山市中医院药务科，广东 佛山 528000)

佛山市中医院骨伤科是国家中医重点专科，其疗伤技法源于清代李氏伤科，通过“师带徒”的形式传承至今，形成了独具岭南特色的诊疗风格，在国内及东南亚地区久负盛名，成功治愈的患者不计其数。佛山市中医院的名老中医不仅以“师带徒”的形式传承了一套独具特色的骨伤治疗手法，而且研制出一批具有南药特色的中药制剂配合治疗。其中，伤科黄水就是中药外治方药中的代表,主要用于治疗跌打损伤、软组织及骨骼损伤等，使用时可将药物直接搽敷于损伤局部发挥药力，疗效较好[1-3]。本研究前期对伤科黄水的化学成分、制剂工艺和质量标准等进行了系统的研究工作，保证了其制备工艺和制剂质量的稳定，初步明确了其临床作用特点[4-10]。但是，在临床用药安全性评价方面一直有所欠缺。随着国家对药品的监管日趋严格，有关院内制剂安全性的研究资料也在逐步完备。尤其是伤科黄水正向中药新药转化，长期毒性的试验资料是新药申报的必然要求。因此，本研究考察了伤科黄水重复多次口服给药对大鼠血液学、凝血功能、血液生化指标和骨髓的影响。

1 材料

1.1 药品

伤科黄水制剂(佛山市中医院自制，医疗机构制剂注册标准为粤ZB20111358，批号为17002，规格为500 ml/瓶)的制备方法：按伤科黄水复方比例称取黄连、黄柏及栀子药材，加水煎煮1.5 h，过滤，收集滤液；药渣加入白矾、紫草药材，再煎煮45 min，加薄荷煮沸15 min，过滤，收集滤液；合并2次滤液，浓缩至规定浓度，加入防腐剂，即得。实验用药配制方法：将伤科黄水原药液浓缩10倍，分别配置成含原药材0.46、0.92和1.84 g/ml的药液，供动物实验用。

1.2 实验动物及分组

SPF级SD大鼠32只，体质量180～300 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。给药剂量参考急性毒性试验的结果设计。前期小鼠急性毒性试验的半数致死量(LD50)为51.66 g/kg，设置1/2的LD50，即25.83 g/kg为本实验的最高剂量，按体表面积折算为大鼠的等效剂量约为18.33 g/kg，低、中剂量分别设置为高剂量的1/4、1/2。据此，为考察性别对实验结果的影响，并减少体质量造成的误差，将SD大鼠按体质量和性别随机均衡分为4组，分别为空白对照组、低剂量组(伤科黄水4.58 g/kg)、中剂量组(伤科黄水9.16 g/kg)和高剂量组(伤科黄水18.33 g/kg)，每组8只，雌雄各半。

1.3 试剂

0.9%氯化钠注射液(湖南科伦制药有限公司，批号：B17061502)；乌来糖(上海抚生实业有限公司，批号：20170105654)；天门冬氨酸氨基转移酶(浙江伊利康有限公司，批号：170301)；丙氨酸氨基转移酶(浙江伊利康有限公司，批号：170201)；肌酸激酶(浙江伊利康有限公司，批号：170602)；γ-谷氨酰转肽酶(浙江伊利康有限公司，批号：170803)；乳酸脱氢酶(浙江伊利康有限公司，批号：170302)。

1.4 仪器

SW-CJ-2FD型净化工作台(苏州净化设备有限公司)；XT-2000iv型全自动血液分析仪(日本Sysmex公司)；7100型全自动生化分析仪(日本日立公司)；CA510型血凝分析仪(日本Sysmex公司)；EASYLYTE型电解质分析仪(美国MEDICA公司)。

2 方法

各组大鼠均以10 ml/kg灌胃给药，1日1次，连续给药14 d。剖检当日处死全部大鼠，进行进行血液学、血清生化学及骨髓等各项检查。

2.1 血液学检查

大鼠禁食至少14 h，采用20%乌拉坦以0.75 ml/(100 g·bw)进行皮下注射麻醉，腹主动脉取血，采血量为1.0 ml，乙二胺四乙酸抗凝。通过全自动血液分析仪测定检测指标。血液样本应及时检测。如未能在抗凝血液制备后1 h内检测，应将样本置于2～8 ℃环境，并在4 h内进行检测。检测时环境温度应控制在15～30 ℃。

2.2 凝血功能检查

大鼠禁食至少14 h，采用20%乌拉坦以0.75 ml/(100 g·bw)进行皮下注射麻醉，腹主动脉取血，采血量为1.5 ml，柠檬酸三钠抗凝，血液离心后取血浆。通过血凝分析仪测定检测指标。血浆样本应及时检测。如未能在抗凝血液制备后1 h内检测，应将样本置于2～8 ℃环境，并在10 h内进行检测。如未能在10 h内进行检测，应置于约-20 ℃环境，并在5 d内进行检测。检测时环境温度应控制在15～30 ℃。

2.3 血清生化检查

大鼠禁食至少14 h，采用20%乌拉坦以0.75 ml/(100 g·bw)进行皮下注射麻醉，腹主动脉取血，采血量应>4.0 ml，室温(25 ℃)存放30 min至4 h，血液离心后取血清。Na+、K+及Cl-浓度用电解质分析仪测定，其余指标用全自动生化分析仪测定。血清样本应及时检测。如未能在血液制备后1 h内检测，应将样本置于2～8 ℃环境，并在24 h内进行检测。如未能在24 h内进行检测，应置于约-20 ℃环境，并在5 d内进行检测。检测时环境温度应控制在15～30 ℃。

2.4 骨髓检查

解剖时，取动物胸骨，将胸骨周围黏附的肉块去除干净，切去骨两端。准备离心管，用注射器吸取未活化胎牛血清或小牛血清0.5 ml，反复冲洗骨髓腔中的骨髓，直至骨髓腔中颜色变浅和细胞悬液颜色淡红均匀，将细胞悬液置于离心管中。采用全自动血液分析仪进行骨髓细胞分类检测。血液样本应及时检测。如未能在骨髓悬液制备后1 h内检测，应将样本置于2～8 ℃环境，并在4 h内进行检测。检测时环境温度应控制在15～30 ℃。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 血液学及凝血功能检查

(1)雌性动物：红细胞体系相关指标，低剂量组大鼠红细胞分布宽度变异系数(RDW-CV)明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。白细胞体系相关指标，高剂量组大鼠中性粒细胞数百分比(NEUT%)明显高于空白对照组，淋巴细胞百分比(LYMPH%)明显短于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。血小板体系及凝血功能指标，中剂量组大鼠凝血酶时间(TT)明显短于空白对照组；高剂量组大鼠血小板分布宽度(PDW)明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。其余各组各指标未见明显差异。(2)雄性动物：红细胞体系相关指标，各组差异无统计学意义(P>0.05)。白细胞体系相关指标，低剂量组大鼠中性粒细胞计数(NEUT)、NEUT%明显高于空白对照组；高剂量组大鼠LYMPH%明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。血小板体系及凝血功能指标，低剂量组大鼠纤维蛋白原量(FIB)明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组各指标未见明显差异。具体结果见表1—3。

3.2 血清生化检查

(1)雌性动物：中剂量组大鼠总胆红素(TBIL)、乳酸脱氢酶(LDH)水平明显高于空白对照组，血糖(GLU)水平明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。其余各组各指标未见明显差异。(2)雄性动物：低剂量组大鼠天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、LDH水平明显低于空白对照组，Tbil水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。中剂量组大鼠丙氨酸氨基转移酶(ALT)、AST水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；三酰甘油(TG)水平明显低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组大鼠GLU水平明显低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组各指标未见明显差异。具体结果见表4。

3.3 骨髓检查

(1)雌性动物：低剂量组PLT、NEUT水平明显低于空白对照组；高剂量组大鼠无核细胞比例明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。其余各组各指标未见明显差异。

表1 伤科黄水连续给药2周对SD大鼠红细胞体系的影响Tab 1 Effects of continuous administration of Shangke Huangshui for 2 weeks on red blood cell system of SD rats n=4)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: vs. the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

表2 伤科黄水连续给药2周对SD大鼠白细胞体系的影响Tab 2 Effects of continuous administration of Shangke Huangshui for 2 weeks on leukocyte system of SD rats n=4)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: vs. the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

表3 伤科黄水连续给药2周对SD大鼠血小板、凝血功能的影响Tab 3 Effects of continuous administration of Shangke Huangshui for 2 weeks on platelet and coagulation of SD rats n=4)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: vs. the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

(2)雄性动物：中剂量组大鼠BASO%明显高于空白对照组，无核细胞比例明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。高剂量组大鼠无核细胞比例明显低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其余各组各指标未见明显差异。具体结果见表5。

4 讨论

伤科黄水复方在临床已有50多年的应用历史，由当代岭南著名的中医骨伤科名家陈渭良主任中医师所创。本方以黄连为君药，清热解毒，燥湿消肿；辅以黄柏、栀子，增强燥湿消肿之功；栀子、紫草兼能凉血活血，以化瘀通脉，共为臣药。伤科黄水洗剂就是在此方基础上研制成型的，并于2000年获得相关专利，作为院内制剂，且主要用于治疗跌打损伤、软组织及骨骼损伤等，具有抗炎消肿、活血化瘀和祛腐生新的功效，深受患者青睐。该制剂研制过程中，考虑治疗骨伤多采用外敷剂型，可以迅速缓解骨伤症状，起到消炎止痛的作用。因此，选择性质相对稳定、制备简便且使用灵活的洗剂作为本制剂的剂型。

在长期临床实践过程中，未发现伤科黄水引起明显的毒副作用。黄连、黄柏是伤科黄水的主要组成药味。有研究结果表明，黄连单味水煎液灌胃给药后，小鼠会出现活动减少、呼吸急促及被毛粗乱的现象，部分小鼠甚至出现痉挛、死亡的情况，剖检结果表明主要毒性靶器官为脑、肝、脾、肺及肾[11]。此外，黄连、黄柏作为苦寒类中药的代表，容易引起稀便甚至腹泻[12-13]。本研究过程中发现，给予伤科黄水后，除偶有大鼠出现软便或稀便外，各组大鼠外观性状未见明显变化。

表4 伤科黄水连续给药2周对SD大鼠血液生化指标的影响Tab 4 Effects of continuous administration of Shangke Huangshui for 2 weeks on blood biochemical index of SD rats n=4)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: vs. the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

表5 伤科黄水连续给药2周对SD大鼠骨髓指标的影响Tab 5 Effects of continuous administration of Shangke Huangshui for 2 weeks on marrow index of SD rats n=4)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

Note: vs. the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

血液学及血液生化指标是长期毒性试验的一项重要内容。伤科黄水外敷对血液功能具有一定影响，可以促进新骨生成，降低血液黏稠度，改善微循环与组织缺氧状态，减轻创面组织水肿情况，促进肉芽组织生长，加快创面结痂，修复疤痕，明显提高创面愈合率，增加成纤维细胞及新生毛细管血管数，提高肿瘤坏死因子α含量[14-15]。因此，有必要进行长期给药后血液相关功能的检查。考虑到伤科黄水为外用制剂，透皮吸收进入血液的成分含量不高，不容易充分暴露潜在的毒副作用，因此，本研究采用口服给药的方式进行实验。

在进行血液学及凝血功能检查过程中发现，(1)雌性动物，低剂量组大鼠RDW-CV升高，提示红细胞体积增大，但是其变异范围在12%左右，且RDW-SD与空白对照组相比无明显差异，可认为RDW-CV仍在正常范围内；高剂量组大鼠NEUT%升高，提示组织损伤或血细胞受到一定破坏，但是其标准差(standard deviation,SD)较大，且NEUT与空白对照组相比无明显差异，可认为NEUT%的差异是由个体差异造成的；高剂量组大鼠LYMPH%降低，提示免疫功能异常，但是其数值变动范围在11%左右，且LYMPH与空白对照组相比无明显差异，可认为LYMPH%仍在正常范围内；中剂量组大鼠TT水平降低，无明显临床意义；高剂量组大鼠PDW水平降低，提示血小板分布宽度减少，但是其数值变动范围在5%左右，且其他血小板指标未见异常，因此无参考价值。(2)雄性动物，低剂量组大鼠NEUT和NEUT%均有所升高，提示组织损伤或血细胞受到一定破坏，但是其SD较大，考虑为个体差异造成的；高剂量组大鼠LYMPH%降低，提示免疫功能异常，但是其数值变动范围在10%左右，且LYMPH与空白对照组相比无明显差异，可认为LYMPH%仍在正常范围内；低剂量组大鼠FIB水平升高，提示血液黏滞性有所增加，但其他凝血指标未见异常，因此无参考价值。

在进行血清生化检查中发现，(1)雌性动物，中剂量组大鼠TBIL水平明显升高，且其他各给药组也有所升高，提示伤科黄水内服对肝胆功能有一定影响，但是考虑到肝为药物代谢的主要器官，且其他指标未见异常，因此认为其引起的TBIL水平偏高一般会在调节后自行恢复；中剂量组大鼠LDH水平虽然明显升高，但因为特异性差，且其他各给药组与空白对照组相比无明显差异，因此无参考价值；中剂量组大鼠GLU水平虽然明显降低，但多为生理性的，无临床意义。(2)雄性动物，低剂量组大鼠AST水平降低，随着剂量增加有升高趋势，但SD较大，考虑样本数太少，需要进一步研究；低剂量组大鼠LDH水平虽然明显降低,但特异性差，无参考价值；中剂量组大鼠ALT水平升高，但是其数值变动范围在10%左右，且其他给药组与空白对照组相比无明显差异，可认为ALT仍在正常范围内；中剂量组大鼠TG水平降低，波动较大，无参考价值；高剂量组大鼠GLU水平降低，多为生理性的，无临床意义。

在进行骨髓检查中发现，(1)雌性动物，低剂量组大鼠PLT水平降低，提示血小板生成减少，但其他各给药组与空白对照组相比无明显差异，且数值波动较大，可认为PLT仍在正常范围内；低剂量组大鼠NEUT水平降低，但NEUT%仍在正常范围内，无临床意义；高剂量组大鼠无核细胞比例降低，无临床意义。(2)雄性动物，中剂量组大鼠BASO%降低，但BASO与空白对照组相比无明显差异，且其他各给药组数值波动较大，可认为BASO%仍在正常范围内；中剂量组和高剂量组大鼠无核细胞比例降低，无临床意义。

综上所述，伤科黄水对血液相关功能未见明显影响。虽然部分指标出现差异，但随着给药剂量增加并未出现规律性变化，因此考虑主要为个体差异造成的。本研究初步排除了伤科黄水的潜在毒性，为进一步进行长期毒性试验和临床观察提供了参考依据。