血友病基因治疗的研究进展

刘嘉榆，郑梦琪，陈 菡，李斌斌，汤 维，章国卫

(杭州师范大学 医学院，浙江 杭州 311121)

血友病是X性联隐性遗传病，是由于凝血因子缺失而导致的凝血障碍。血友病A患者缺失凝血因子VIII(FVIII)，FVIII基因较大(180 kb)且其蛋白结构复杂，血友病B患者缺失凝血因子IX(FIX)，FIX基因相对较小(34 kb)且其蛋白结构较为简单。基因及蛋白结构的不同导致血友病A和血友病B在疾病的发生、特点以及产生的抑制物的危险程度上都有区别。血友病A患者占血友病患者总数的85%，血友病A重度患者的比例(45%)高于血友病B(35%)，血友病A患者产生中和抗体的比例高于血友病B患者[1]。

随着基因与载体研究的突破，血友病的基因治疗获得了较大的发展。维持长期高浓度的凝血因子表达是血友病基因治疗的主要问题，通过改造凝血因子编码基因以增加基因表达效率或增强凝血因子活性成为提高基因治疗效果的一个重要途径。应用于基因治疗的病毒载体主要包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、逆转录病毒载体和慢病毒载体(LV)，血友病基因治疗主要集中于使用腺相关病毒载体和慢病毒载体。同时，基因组编辑工具(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas9)的发展也为基因治疗提供了新的手段。本文围绕治疗基因、载体和靶细胞，总结血友病基因治疗的研究进展，对血友病基因治疗的优势和风险做综合性分析。

1 治疗基因

1.1 FIX基因 高凝血活性FIX突变体FIX-R338L的发现为血友病B的基因治疗提供了新途径。FIX-R338L发现于一名易栓症病人，是自然发生的单氨基酸替换的FIX突变体，FIX的338位的精氨酸被亮氨酸替代，导致FIX的催化结构域发生改变，使其在维持相同蛋白表达水平的情况下活性增加到野生型FIX的5～10倍[2]。动物实验证实利用病毒装载的FIX-R338L进行血友病B的基因治疗可以在降低载体浓度的情况下仍显著提高FIX活性及其治疗效果，从而可降低载体蛋白在血浆中的暴露量，减轻由于载体蛋白而引起的肝脏损伤和免疫反应。2015年，Spark公司报道了以FIX-R338L进行I/II期临床试验的结果，以腺相关病毒(AAV)包装的FIX-R338L(SPK-9001)对10个血友病B病人进行注射，注射剂量为5×1011mg/kg。52周的持续监测中，FIX平均活性为正常的(33.7±18.5)%，9人在治疗后没有发生出血事件，8人完全停止了FIX的输注[3]。Nathwani等[4]以正常FIX进行的基因治疗临床试验中，AAV病毒剂量为2×1012vg/kg，FIX的最高活性为12%。病毒剂量下降一个数量级，FIX-R338L可使FIX活性增加，证明该突变体具有较大的临床应用前景，为血友病的治疗研究提供了一个新的方向。

1.2 FVIII基因 过大的基因长度和复杂的蛋白质结构增加包装和表达FVIII的难度，密码子优化可提高FVIII的表达水平。FVIII的结构域包括A1-A2-B-A3-C1-C2，删除B结构域可减少FVIII基因的长度且不影响其活性，使FVIII基因可被病毒载体包装而应用于基因治疗。BioMarin公司使用经密码子优化的B结构域缺失的人FVIII基因(FVIII-BDD)，以AAV5病毒作为基因载体开展了一项血友病A的I/II期临床研究[5]，高剂量组的所有7名患者治疗后血浆FVIII活性都超过5%，其中6名患者一年内FVIII水平均维持在50%～150%；所有患者都停止了预防性治疗所需的FVIII注射，出血事件从治疗前的每年16次下降到1次，患者中未发现FVIII抑制物的产生。Miao等[6]发现，与完全删除B结构域的FVIII相比，保留B结构域中N端的226个氨基酸及其6个天冬氨酸残基上连接的N-糖基部分能使FVIII的分泌增加10倍；如果同时将A1结构域中309位的苯丙氨酸突变为丝氨酸可进一步增加FVIII的分泌。McIntosh等[7]用包含了6个糖基化位点的17个氨基酸残基的多肽序列代替226个氨基酸残基的间隔序列进一步缩短了FVIII基因的长度，使FVIII的表达水平增加了2倍；结合高效的肝特异性启动子形成的表达框架可更高效地包装进AAV载体中，在小鼠和猴血友病A模型中形成更高的FVIII表达水平。

Siner等[8]模仿狗FVIII-BDD，将人FVIII-BDD Furin识别序列处的精氨酸突变成组氨酸(hFVIII-R1645H)后，可使单链形式的人FVIII-BDD分泌增加到原来的2倍；同时删除Furin识别位点使FVIII以单链形式合成，在体内和体外试验中都可增加FVIII的分泌[9]。也有研究[10]指出，将位于A1结构域第309位的苯丙氨酸突变为丝氨酸可增加FVIII的分泌。

Doering等[11]在A1和A3结构域引入猪FVIII序列构建了人/猪杂交FVIII表达序列，该表达序列可产生高达人FVIII 10倍的表达量。近期，该团队通过分子进化学手段对不同动物中的FVIII进行序列比对，利用祖先序列重建(ancestral sequence reconstruction，ASR)技术获得与人FVIII具有95%同源性的表达能力更强的FVIII表达序列，其FVIII表达水平在血友病A小鼠中显著增加[12]。

2 载体

2.1 腺相关病毒载体 AAV是一种无包膜、单链DNA病毒，具有低免疫原性、长期转基因表达能力、基本不与宿主染色体整合的特性。Nathwani等[4]首次用AAV8介导血友病B基因治疗临床试验，实现了长期的基因表达。后续，Spark公司以AAV包装FIX-R338L[3]，BioMarin公司以AAV5包装FVIII基因[5]成功进行了血友病的基因治疗临床试验。

但AAV基因治疗还面临着许多问题，首先，AAV的基因容量只有5 kb左右，需精确设计FVIII编码序列、优化启动子及其他必须序列的长度，才可保证FVIII的表达水平。其次，由于AAV中和抗体在人群中广泛存在，现有的AAV基因治疗只对不含或含很少抗AAV中和抗体的血友病患者适用。此外，AAV基因组是非整合的，存在治疗基因缺失和在儿童体内基因被稀释的可能性。抗AAV中和抗体在首次治疗之后会产生，通过清除血浆抗体或免疫抑制可达到对产生抗体患者进行治疗的目的，但其副作用仍然是需要考虑的问题[13]。从病毒的角度来看，更换不同血清型AAV可以成为解决这一问题的一个方法。Majowicz等[14]在小鼠和非人类灵长类动物中证实在富含AAV5中和抗体的动物中注射AAV1可实现转移基因的表达。通过改变病毒衣壳蛋白的抗原表位以避免中和抗体的识别也是可采取的一项策略。Tse等[15]运用分子进化学手段分析AAV抗原表位的保守区域并进行突变筛选，获得新的AAV突变体，可逃避已有AAV中和抗体的攻击，但仍会在注射后诱发机体产生相应的中和抗体，从而难以应用于二次注射。

2.2 慢病毒载体 作为逆转录病毒载体，LV可运载相对较大的基因片段，实现目的基因稳定整合到靶细胞基因组。LV目前被开发用于离体基因治疗[16-22]和体内基因治疗[23]。运用离体基因治疗策略，通过LV将FVIII或FIX基因导入造血干细胞中，结合使用不同的特异启动子，可实现FVIII和FIX在血小板中储存并发挥治疗作用，或使表达的FVIII或FIX分泌入血浆发挥治疗作用[11,24]。LV也可转导外向生长内皮细胞或B细胞，经移植后在体内表达凝血因子[25-26]。体内基因治疗策略中采用静脉直接注射LV易触发机体的免疫反应而使LV失活。在小鼠和狗的血友病B模型中，在LV载体中引入抗原递呈细胞特异表达的microRNA142以抑制治疗基因在细胞中的表达，可大大降低免疫反应的发生；通过静脉注射使LV能稳定地将目的基因转移到肝脏，选择肝细胞特异性的启动子可使转基因表达严格限定于肝细胞[27]。Staber等[28]在用猫免疫缺陷病毒构建的LV中引入杆状病毒GP64包膜蛋白，使LV具备肝细胞的靶向性；在血友病A小鼠中静脉注射该病毒实现了FVIII的表达与治疗。Miao等[29]通过骨内注射LV成功转导了骨髓造血干细胞，实现FVIII在血小板中的表达。

2.3 CRISPR/Cas9 在小向导RNA(small guide RNA, sgRNA)的指引下，Cas9蛋白与DNA靶序列邻近原始间隔区相邻基序(PAM)的特定位点相互作用并引起DNA双链断裂(DSB)。 DSB的产生可诱导两种DNA修复途径：同源重组修复(HDR)和非同源末端连接重组修复(NHEJ)。利用这两种修复途径可实现基因组编辑的目的并应用于基因治疗中。CRISPR/Cas9需通过不同的方式导入细胞才能发挥作用，病毒载体仍然是高效率的选择。在血友病B小鼠中，以腺病毒为载体的CRISPR/Cas9介导的基因导入被证明能实现FIX基因的矫正，恢复小鼠凝血功能。但由腺病毒引发的免疫反应及肝脏毒性仍然是影响治疗效果的一个重要问题[30]。相比腺病毒，AAV具有更低的机体免疫反应和肝脏毒性。通过AAV介导也可成功地实现FIX基因编辑与修复[31]。CRISPR/Cas9在基因治疗中的临床应用仍需解决由于脱靶效应而造成的基因突变的风险以及Cas9蛋白过大不易包装入AAV等问题。

3 靶细胞

3.1 肝细胞 肝脏是凝血因子的主要合成部位，是血友病基因治疗的主要靶细胞。已公开报道的成功的血友病基因治疗临床试验都采用了以肝细胞作为靶细胞，以AAV作为载体的体内基因治疗策略[3-5]。利用LV进行靶向肝细胞的基因治疗在动物实验中观察到了治疗效果[27]。Barzel等[32]利用AAV为载体，采用同源重组策略成功地将FIX基因插入到了小鼠肝细胞基因组清蛋白基因后，利用清蛋白的启动子表达了FIX，该策略不额外导入外源启动子增加了基因治疗的安全性。由于FIX治疗基因整合到小鼠基因组中可以长期稳定表达，有研究者尝试运用基因组编辑技术对肝细胞进行基因矫正以达到治疗目的[33]。直接注射病毒载体较易引起机体的免疫反应及对肝脏的毒性作用，且不适于治疗产生抑制物的患者。但也有证据表明靶向肝细胞的基因治疗具有免疫耐受性，甚至可清除已存在的抑制物[34]。

3.2 造血干细胞及多种血细胞 造血干细胞的自我更新和分化能力能为患者持续提供血细胞。利用整合载体可实现目的基因在造血干细胞基因组中的稳定整合，使治疗基因在造血干细胞分化的后代中持续表达。利用组织特异性的启动子可实现治疗基因在不同分化细胞中的特异表达，如使用珠蛋白启动子可使FIX在红细胞中表达[35]，使用CD68启动子可使FVIII在单核细胞中表达[11]，两者都可在血浆中恢复相应的凝血因子活性，起到促进凝血的治疗作用。使用血小板特异的启动子可使FIX和FVIII在血小板中表达并储存[36-37]，该基因治疗策略的特点是将凝血因子局限在血小板中，只有血小板在出血部位被激活时才释放出来促进凝血，可提高出血部位的凝血因子局部浓度；由于血小板的隔离作用，血小板FVIII可在抑制物存在的情况下仍发挥促凝血作用，这项策略有可能成为针对已产生抑制物的血友病A患者的基因治疗方法。此外，通过LV直接转导B细胞也可实现FIX在B细胞中的表达[26]。

4 结论

血友病的基因治疗在不断探索中走向成熟，以AAV作为载体的靶向肝脏的基因治疗临床研究展现出极大的应用前景。功能增强的FIX基因突变体FIX-R338L在增强血友病B的基因治疗效果方面展现出功效。通过改进FVIII表达框架可提高FVIII表达效率，进一步提高FVIII的表达与活性是使血友病A基因治疗最终获得临床应用的关键；是否可获得类似FIX-R338L的高活性FVIII突变体仍有待进一步的研究。LV和造血干细胞结合的离体基因治疗模式可能成为血友病基因治疗的一条重要途径。靶向血小板表达的FVIII在抑制物存在下仍能起到治疗作用，是针对抑制物设计的基因治疗策略。基因编辑等新技术的应用也可为血友病的基因治疗开辟新的途径。