保健灸关元穴对老年大鼠血清和肠道氧化及炎症反应的影响

欧阳夏荔 段浩茹 金 琪 赵百孝 韩 丽 罗 雪 赵思雨 张高钰 张杨旖旎 程元元

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.中国中医科学院眼科医院内障眼病科，北京 100029；3.北京中医药大学中医学院，北京 100029

衰老通常是指在正常情况下生物体发育成熟后，随着年龄增长机体发生的功能性和器官性衰退的渐进过程[1]。由于免疫系统功能显著下降，机体对内、外环境的适应能力减弱，人体在结构和功能上可出现多种退行性变化，尤其对肠道免疫功能的影响较大。肠道作为机体抵御病原体的第一道防线，在多种急慢性疾病的发生、发展中起至关重要的作用[2]。研究发现，机体衰老常出现肠道功能障碍及慢性炎症，可能是由肠道菌群种类减少、渗透性增强所致[3]。因此抗肠道衰老也逐渐成为老年医学领域研究的重点和热点。艾灸疗法在抗衰老方面具有不可替代的优势。研究其作用机制对于提高艾灸抗衰老的临床疗效和推广应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本实验选用6 只清洁级12 周龄青年Wistar 雌性大鼠，体重（283.47±15.77）g，12 只清洁级36 周龄老年Wistar 雌性大鼠，体重（357.92±27.93）g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养环境：采用人工控制的室内照明，保持12 h 光照（8:00～20:00）和黑暗（20:00～次日8:00）交替循环。室温（22±2）℃，室内湿度50%～60%。所有动物用标准饲料、清洁饮用水适应性饲养1 周后，按照随机数字表法将12 只正常老化雌性Wistar 大鼠分为老年组（n=6）和保健灸组（n=6），6 只青年雌性Wistar 大鼠为青年组。本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

特制细艾条（三年陈艾条，规格0.5 cm×12.0 cm，河南南阳汉医艾绒有限公司）；特制大鼠固定器（呈圆柱形，底面直径8 cm，高20 cm）；ZK380 低温离心机（产地：德国）；Thermo Multiskan MK3 酶标仪（产地：芬兰）；Peri Flux 5000 激光多普勒血流仪（产地：瑞典）；Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron 全自动生化分析仪（产地：美国）；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（Lot：20180711）、丙二醛（MDA）检测试剂盒（Lot：20180710）均购于南京建成生物工程研究所；大鼠白细胞介素（IL）-1β 酶联免疫吸附测定试剂盒（瑞格博，rgb-60013r）；大鼠IL-6 酶联免疫吸附测定试剂盒（瑞格博，rgb-60023r）；大鼠IL-10 酶联免疫吸附测定试剂盒（瑞格博，rgb-60026r）；大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α 酶联免疫吸附测定试剂盒（瑞格博，rgb-60080r）。

1.3 干预方法

将三组大鼠腹部关元穴穴区直径约1.0 cm 的鼠毛剃干净。青年组和老年组：抓取大鼠放入特制固定器中，不施加其他干预手段，20 min/d，连续40 d；保健灸组：抓取大鼠放进特制固定器中，使其腹部对准固定器底部的开口，开口下方放置点燃的艾条，对准大鼠关元穴（图1），艾条距离穴位皮肤（30±5）mm，通过调节插进艾条底部的钉座高度，及时调整艾条与大鼠的距离，使艾灸时的温度基本保持恒定。艾灸干预20 min/d，连续40 d。

1.4 观察指标

图1 保健灸组大鼠艾灸操作图

干预40 d 后，各组大鼠禁食不禁水24 h，测量体重后，将各组大鼠用3%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，股动脉取血，室温静置1 h，以3500 r/min（半径72 mm）在低温环境下（4℃）离心15 min，取上清液于-80℃低温冰箱保存，待测；取血后，迅速沿腹正中线开腹，快速剪取大鼠结肠道，采用纵向剖开后生理盐水冲洗3 遍，迅速液氮冰冻保存备用。根据SOD 检测试剂盒、MDA检测试剂盒说明书检测血清及肠道SOD、MDA 水平；根据酶联免疫吸附测定试剂盒说明书检测肠道中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平；采用激光多普勒血流仪检测关元穴微循环血流灌注量，配用Probe407 小型光导纤维直探头，输出激光波长780 nm，最大输出功率1 mW，反射时间设定为0.2 s。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件对实验数据进行分析。依次对数据进行正态性检验和方差齐性检验，若两者均符合，所有数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD 方法。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清及肠道SOD、MDA 水平比较

图2 各组大鼠肠道炎症因子表达水平比较

与青年组比较，老年组血清及肠道SOD 水平降低（P <0.05 或P <0.01），MDA 水平升高（P <0.05 或P<0.01）；与老年组比较，保健灸组肠道SOD 水平明显升高（P<0.01），MDA 水平明显降低（P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清及肠道SOD、MDA 水平比较（±s）

表1 各组大鼠血清及肠道SOD、MDA 水平比较（±s）

注：与青年组比较，*P <0.05，**P <0.01；与老年组比较，△△P <0.01。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.2 各组大鼠肠道炎症因子表达水平比较

与青年组比较，老年组肠道促炎因子IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10 表达水平升高（P <0.05）；与老年组比较，保健灸组肠道IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 水平显著降低（P <0.01）。见图2。

2.3 关元穴微循环血流灌注量

青年大鼠关元穴的血流灌注量多在140～250 PU，而老年大鼠多为50～80 PU。与青年组比较，老年组关元穴微循环波峰降低，波幅变小，血流灌注量大幅下降；与老年组比较，保健灸组关元穴微循环波峰上升，波幅变大，血流灌注量明显上升。见图3。

图3 大鼠关元穴血流灌注量

3 讨论

随着年龄增长、外界因素变化，人体内抗氧化物质减少，防护功能减退或发生障碍，自由基累积性增加[4]。活性氧自由基可侵害细胞，与细胞内的核酸、蛋白质、脂质等生物大分子发生反应，从而引起一系列细胞结构和功能的改变，最终形成代谢产物MDA，导致机体的病变和衰老[5]。因此，MDA 不仅是间接评价细胞损伤的重要指标，同时能反映机体的衰老程度。SOD 是一种存在于细胞液中的抗氧化酶，可清除人体代谢过程中产生的自由基，保护组织免受自由基的损伤，因而SOD 活性可以反映组织抗氧化的能力。本实验结果显示，自然衰老大鼠局部组织和全身都显示出衰老迹象，并伴有明显的抗氧化能力的减弱，艾灸老年大鼠关元穴，首先引起腹部局部组织器官效应[6]，缓解局部组织大肠的细胞损伤情况并提升其抗氧化能力。

众所周知，氧化应激可影响肠道屏障，导致肠黏膜屏障功能受损，增加肠道的通透性。促炎因子通过肠上皮细胞进入血液循环，伴随着炎症细胞因子的长期失调，局部组织和机体将处于持续性的慢性、低度的炎症状态[7-8]。这种在自然衰老进程中发生的状态，有学者称之为炎症衰老[9-10]。队列研究也表明，IL-6 和TNF-α 水平是机体衰弱的标志[11]。此外，许多与老年有关的慢性疾病，例如糖尿病和心血管、肾、肺和骨骼肌疾病也与氧化应激和炎症反应直接相关[5，12-14]。通过本实验知道，自然衰老大鼠肠黏膜处于炎症状态，促炎因子IL-6、TNF-α 表达水平升高，而长期持续性的炎症反应导致抑炎因子IL-10 表达水平随之升高，通过艾灸老年大鼠的关元穴，肠道促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β 的表达水平显著降低，其炎症状态明显改善。

鉴于上述氧化应激、炎症两者与衰老的密切关系，De la Fuente 等[15]提出氧化-炎症衰老学说。研究认为，促炎因子增多使肠道黏膜蛋白发生结构、数量的变化，是肠道屏障功能障碍的主要机制[16]。促炎细胞因子又可诱导细胞衰老，并使其分泌生长因子、蛋白酶、化学因子和细胞因子等[17]，引起组织损伤，使机体产生严重的炎症反应[18]。促炎细胞因子与细胞衰老两者间可能产生互为因果的恶性循环，进而又加速了炎症衰老的进程[19]。

综上，从艾灸自然衰老大鼠关元穴对其血清和肠道氧化及炎症反应的影响来看，艾灸关元穴不仅可以提高局部组织器官的抗氧化能力，还能减轻其炎症反应。自古就有灸关元以治病养生和“针必取三里，灸必加关元”之说。关元穴位于任脉上，是人体元阴元阳的交关之处，能补益人体真火，强壮补肾[20]，治疗各种虚损性疾病，从而起到延缓衰老的作用。艾灸的一个十分重要的治疗因素是热效应，穴位处组织的温度升高可以提高血液的流动速度。流动的血细胞反射出的光在频率上产生频移，当激光多普勒血流仪通过光纤发出激光束，到达测定组织表面时发生反射从而测得穴位组织血流灌注量，其大小与血细胞运动的速度成正比。老年大鼠皮肤微循环血流量减少，艾灸关元穴可以增加穴位血流灌注量，从而减少局部组织代谢物的堆积和炎症浸润。