肝母细胞瘤分子标志物检测、异体移植模型建立及靶向治疗

杨 艳 顾 远 李 健 董 瑞 余发星, 董岿然

肝母细胞瘤(HB)是儿童最常见的肝脏恶性肿瘤[1-3]。其年发病率百万人中1.2～1.5人，目前发病率仍在不断上升[1]，发病机制目前尚不明确。顺铂是目前治疗方案中主要的化疗药，但此药对患儿有较大的不良反应，具有耳毒性和肾毒性[4]。因此，分子靶向治疗药物的研发显得尤为紧迫和重要。

近年研究发现，在肝母细胞瘤中同时存在着Hippo和Wnt通路的异常激活[5-10]。Hippo通路是一条进化及其保守的分子信号通路，对包括肝脏在内的不同器官的大小控制有着深远的影响，在肝脏肿瘤的发生中发挥重要作用[11-13]。Wnt通路是多细胞生物发育过程中重要信号通路[14]。YAP和β-catenin分别为Hippo和Wnt通路的关键效应分子，约79%的肝母细胞瘤样本中，可发现二者同时在核内高表达[10]，提示两条通路在肝母细胞瘤的发生发展中起着关键作用。在小鼠动物模型中，YAP和β-catenin基因表达快速导致HB的发生和发展[10]。因此，YAP和β-catenin在HB的发生发展过程中至关重要，而抑制YAP和β-catenin活性是HB治疗的新思路。

Tankyrase 1和2(TNKS1/2)是聚二磷酸核糖聚合酶(PARP)的组成成分，又称PARP5a/b。TNKS1/2可诱导AMOT和AXIN1核糖基化(PARylation)，进而触发E3连接酶RNF146介导的泛素化以及蛋白酶体介导的降解[15-20]。AMOT和AXIN1分别是YAP和β-catenin的负调因子，因此TNKS1/2的活性与YAP和β-catenin呈正相关。XAV939是一种TNKS1/2的小分子抑制剂，能够稳定AMOT和AXIN1的活性，继而使YAP和β-catenin失活。因此，XAV939有潜力成为HB治疗的先导药物。

1 方法

1.1 研究路线 本研究旨在探讨TNKS1/2抑制剂XAV939在HB发生发展过程中的功能。图1显示，检测YAP和β-catenin在中国HB患儿肿瘤组织标本中的活化状态，进而在HB细胞中检测XAV939对YAP和β-catenin的抑制作用，同时构建HB小鼠PDX，并在HB PDX模型上检测XAV939对HB发生发展的作用。

图1 研究总体设计及路线图

1.2 伦理和知情同意 本研究方案获复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会批准，所有研究对象的法定监护人均签署知情同意书。

1.3 免疫组化染色(IHC)标本 选取HB患儿肿瘤及瘤旁肝脏组织标本，福尔马林固定后进行切片，行苏木精和伊红(H&E)染色，观察肿瘤组织学亚型和肿瘤分级；同时进行IHC实验，检测目标抗体在肿瘤及瘤旁组织中的表达情况。

1.4 细胞实验 HuH6细胞培养在在含10%胎牛血清(Gibco)和50μg·mL-1的双抗(青霉素/链霉素)DMEM中，置于5% CO2的37℃培养箱中。XAV939和olaparib均购买自Selleck，并根据其说明剂量用于细胞实验。

1.5 建立PDX模型 实验所用小鼠为8周龄的雌鼠，购自斯莱克实验动物有限公司，饲养于SPF清洁级环境中。选取确诊为HB并予以手术切除的新鲜肿瘤组织，将其切分成0.5 cm×0.5 cm的组织块，用生理盐水冲洗后，迅速移植到裸鼠皮下。当肿瘤生长到1～2 cm3时(肿瘤体积=长径×短径2/2，数值由游标卡尺计量，精确到0.1 cm)，处死裸鼠，取下肿瘤块按照上述方法进行传代或快速冷冻保存。将获取到的PDX肿瘤组织进行H&E染色和IHC染色，以检测其与原代肿瘤组织的保真度。

1.6 PDX模型的药物实验 ①顺铂和XAV939药物试验：腹腔内注射给药，将PDX小鼠分为空白组(生理盐水)、顺铂(每周3 mg·kg-1)、XAV939(每天2 mg·kg-1)和顺铂+XAV939组(剂量同单独顺铂和XAV939)；②索拉非尼和瑞格菲尼药物试验：将PDX小鼠分为空白组(腹腔内注射生理盐水)、顺铂(每5天腹腔内注射1次，每次3 mg·kg-1)、索拉非尼(经口给药，每天40 mg·kg-1，连续给药5 d后，每2天给药一次，至15天)和瑞格菲尼(经口给药，每天20 mg·kg-1，至15天)。实验期间，每日记录PDX小鼠皮下肿瘤大小和小鼠体重。实验结束时取肿瘤组织，测量肿瘤重量，测小鼠血清中AFP浓度。

1.7 IHC HB肿瘤、癌旁组织及PDX肿瘤组织的石蜡切片及H&E染色均由武汉谷歌生物科技有限公司完成，其中部分切片被用来行IHC实验，实验方法参考文献[22]。将石蜡切片运用二甲苯、浓度梯度酒精脱蜡后，使用柠檬酸钠封闭抗原氧化物15 min，再用3%羊血清(3% BSA/PBS配制)封闭1 h，然后滴加上一抗放入湿盒中，静置于4℃冰箱过夜。第2日滴加二抗(anti-rabbit HRP, Dako, K4003)孵育2 h，用GTVision Ⅲ IHC detection kit (GK500705; GeneTech)显色。最后用浓度梯度酒精和二甲苯逐步脱水封片，晾干后于光镜下拍照。YAP (14074; 1∶100稀释) 和β-catenin(8480; 1∶100稀释) 抗体购买于CST(Cell Signaling Technology), AFP(ab169552; 1∶100 稀释) 购买于Abcam。β-catenin的染色强度设定为4级，4为最强，1为最弱，1：膜定位，2：胞质普遍表达，3：核内弱表达，4：核内强表达:。YAP在组织细胞中的染色强度分为4级，4为最强，1为最弱，1：无表达，2：弱表达，3：胞内高表达、核内弱表达，4：胞内高表达、核内强表达。

1.8 蛋白印迹实验(WB) 蛋白印迹实验参考文献[23]。所使用的一抗如下：YAP (14074; 1∶1 000 稀释), p-YAP (S127, 4911; 1∶1 000 稀释), AXIN1(2087; 1∶1 000 稀释), Active β-catenin (8814; 1∶1 000 稀释), Vinculin (13901; 1∶3 000 稀释)，以上抗体均购于CST；AMOT (A303-305A; 1∶1 000 稀释) 购买于Bethyl Laboratories, CYR61 (sc-13100; 1∶500 稀释) 购买于Santa Cruz Biotechnology, β-catenin (610154; 1∶2 000 稀释) 购买于BD Biosciences, AXIN2 (PA5-25331; 1∶1 000 稀释) 购买于Invitrogen。

1.9 定量RT-PCR 提取总RNA的试剂盒为Takara MiniBEST universal RNA Extrction kit，cDNA由TransScript First-Strand cDNA synthesis kit (TransGen Biotech)合成，qPCR实验系统为SYBR Green qPCR Master Mix (TaKaRa) on 7500 fast and 7500 Real-Time PCR systems (Applied Biosystems)。引物序列参考参考文献[23-25]。

1.10 数据分析 统计分析采用单因素方差分析或双因素方差分析。P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 β-catenin和YAP在HB患儿的病理标本中激活 选取2014至2017年在我院病理确诊的20例HB患儿肿瘤及瘤旁肝脏组织标本(表1)。图2A显示，根据IHC染色结果，将β-catenin和YAP的染色情况分为4级别(其中1为膜定位/无表达， 4为核内强表达/胞内高表达、核内强表达，2和3介于二者之间)。在正常肝脏组织中，β-catenin主要在肝细胞的细胞连接处表达，YAP在肝细胞中表达较弱，在胆管细胞中表达较强(箭头所示)。图2B和C显示，在HB组织中，β-catenin和YAP的表达均显著升高，几乎所有肿瘤组织出现β-catenin和YAP的细胞核染色。同时，β-catenin和YAP的活化程度在不同的HB样本中呈高度正相关(图2D)。

2.2 XAV939抑制HB细胞中β-catenin和YAP活性 为了测试抑制TNKS1/2是否能调节HB细胞中Wnt和Hippo通路，使用了tankyrase抑制剂XAV939或PARP1抑制剂Olaparib处理Huh6细胞。XAV939处理后的细胞中AMOT(130 kDa亚型)和AXIN1的表达水平有所升高；相反，YAP磷酸化(蛋白失活)有所增加，β-catenin蛋白非磷酸化(蛋白活化)水平降低。此外，在XAV939处理的细胞中，YAP和β-catenin的靶蛋白CYR61和AXIN2的表达水平均降低(图3A)。在mRNA水平， YAP的3个靶基因(ANKRD1,CTGF, 和CYR61)和β-catenin的2个靶基因(AXIN2和LGR5)在XAV939处理的细胞中表达显著下降(～50%,P<0.01)(图3B)。Olaparib处理的细胞中YAP和β-catenin靶基因表达没有明显变化(图3，P>0.05)。结果表明，XAV939能够在HB细胞中特异抑制YAP 及β-catenin，具有抑制HB发生发展的潜力(图3C)。

2.3 肝母细胞瘤PDX模型的建立 选取2017年5～11月我院11例确诊为HB并予以手术切除的新鲜肿瘤组织，行PDX模型构建，最终成功建立了4例PDX模型，其中2例可在冷冻保存后进行复苏再次在裸鼠皮下成瘤(表2)。87号患儿的肿瘤组织同瘤旁正常组织相比，其YAP、β-catenin和AFP的表达高于后者(图4)。在第1～3代所收集的PDX肿瘤组织中，可见肿瘤细胞形态与原发肿瘤一致，而在PDX肿瘤组织中YAP、β-catenin和AFP的表达略高。 HB PDX能够很好地模拟原发HB病理形态，是检测HB候选药物疗效的良好工具。

表1 20例HB患儿肿瘤及瘤旁肝脏组织标本

注 肿瘤依据Pre-TEXT 标准分级

图2YAP及β-catenin在HB样本中活化情况

注 A：HB肿瘤及癌旁组织中YAP及β-catenin表达水平及亚细胞定位。根据染色强度及细胞核定位将YAP及β-catenin表达水平分为四级，1-4级分别代表低到高的蛋白表达水平及细胞核定位。箭头指示胆管。比例尺：20 μM。空白处没有对应样本。B：HB中β-catenin活化(t检验，P<0.000 1)。 C：HB中YAP活化(t检验，P<0.000 1)。D：HB中β-catenin及YAP活化水平呈正相关，黑圈大小代表样本数量(对应右方数字)，r=0.4233，P=0.03

图3TNKS1/2抑制剂XAV939对YAP及β-catenin活性的抑制

注 A：XAV939处理Huh6细胞后，AMOT p130及AXIN1蛋白稳定性上升，YAP及β-catenin失活，靶向基因CYR61及AXIN2表达水平下降.PARP1抑制剂Olaparib无显著效应。B：XAV939抑制YAP及β-catenin靶向基因mRNA表达。C：XAV939治疗HB机制设想。XAV939抑制TNKS1/2,导致AMOT及AXIN1上升，YAP及β-catenin失活，从而抑制HB发生发展

表2 PDX相关病例信息及PDX构建情况

2.4 不同药物对HB PDX肿瘤生长的影响 ①顺铂和XAV939药物试验：将87号患儿所建立的PDX模型行传代扩增至第5代时共产生16只PDX小鼠，随机将PDX小鼠分配至空白组、顺铂组、XAV939组和顺铂+XAV939组，每组各4只，至24 d时处死PDX小鼠取下肿瘤组织；②索拉非尼和瑞格菲尼药物试验：87号患儿所建立的PDX模型行传代扩增至第9代时共产生20只PDX小鼠，随机将PDX小鼠分配至空白组、顺铂组、索拉非尼组和瑞格菲尼组，每组各5只。药物实验为期15 d时处死PDX小鼠取下肿瘤组织。

顺铂和XAV939药物试验：图5A～C显示，顺铂和XAV939药物试验中，顺铂组和顺铂+XAV939组与空白组和XAV939组比较，肿瘤生长抑制作用强(P<0.05)、血浆AFP水平低(P<0.05)，小鼠体重增长少；图5D显示，顺铂组和顺铂+XAV939组比空白组和XAV939组肿瘤重量增长少(P<0.05)，需要说明的是，图5A显示的空白组和XAV939组较顺铂组和顺铂+XAV939组有更好体重表现，是因为空白组和XAV939组肿瘤重量占据了体重的比例更多；图5A～C也显示，顺铂组较顺铂+XAV939组在肿瘤生长抑制作用、血浆AFP水平和小鼠体重增长差异无统计学意义(P>0.05)，说明顺铂+XAV939无协同作用。

索拉非尼和瑞格菲尼药物试验：图5E显示，肿瘤组织重量方面，顺铂组、索拉非尼组和瑞格菲尼组差异无统计学意义，索拉非尼组和瑞格菲尼组与空白组差异无统计学意义，仅顺铂组与空白组差异有统计学意义。

3 讨论

Hippo和Wnt通路在肿瘤的发生发展中起着重要作用。而YAP和β-catenin在HB中的异常激活的发现，提示这两条通路或可成为HB的治疗靶点。由于TNKS1/2抑制剂已被证明能有效抑制YAP和β-catenin的活性，因此，检测TNKS1/2抑制剂对HB的作用效应则显得尤为重要。

本研究发现YAP和β-catenin在中国HB患儿中同时被异常激活，但未检测到β-catenin和YAP的表达与肿瘤分级的相关性，推测可能与本次研究的HB样本数量较少有关。Huh6细胞最初由一位日本学者从一位1岁的日本男性肝母细胞瘤患儿的肿瘤标本中分离培养而来，为研究历史最久的一株细胞系，也是目前唯一可用的HB细胞系[26]。本研究在细胞实验部分，证实了TNKS1/2抑制剂，即XAV939，有效地抑制了HB细胞系HuH6中YAP和β-catenin的活性。随后建立的HB的PDX肿瘤模型，保留了HB原发肿瘤的组织学和分子生物学特性，并且检测到PDX肿瘤的生长能被顺铂有效抑制，顺铂是目前用于HB化疗的基础用药。索拉非尼和瑞格菲尼现主要用于治疗成人肝细胞癌(HCC)，属于激酶抑制剂，也表现出了一定的肿瘤生长抑制作用，尤其是索拉非尼，但结果不具有统计学意义，推测主要是由于实验的样本数量有限所致(图5E)。然而，本研究建立的PDX模型中，XAV939未能抑制肿瘤的生长，表明XAV939不是治疗HB的理想候选者。

图4原代肿瘤及PDX肿瘤H&E及IHC染色

注 HBC87: 87号肝母细胞瘤肿瘤标本，HBP87：87号肝母细胞瘤瘤旁正常肝脏组织标本，P1、P2及P3分别代表第1～3代对应PDX组织。从H&E及AFP染色可以看出，原代肿瘤及PDX肿瘤二者均表现为核嗜碱性、核大深染、胞质少、胞质嗜碱性、AFP阳性等病理特性。YAP、β-catenin的IHC染色可见原代肿瘤及PDX肿瘤均有强染色反应，表示组织中存在着Hippo通路和Wnt通路的异常激活。 比例尺：20 μm

XAV939对PDX肿瘤的生长影响不明显，可能由诸多原因所致。首先， XAV939在小鼠体内的药代动力学尚不清楚。本研究采用的腹腔注射法可能无法有效地将XAV939运送至肿瘤。本研究未检测到XAV939组的肿瘤组织中AMOT和AXIN1浓度的显著升高，表明XAV939可能未至肿瘤组织中。在未来的研究中可尝试其他具有更好在体表现的TNKS1/2抑制剂进行PDX药物实验。其次，XAV939在实体肿瘤内可能无法稳定AMOT和AXIN1。此前大多数与XAV939相关的研究均在体外细胞系中进行，而其在体实验的相关研究则相对缺乏。因此，今后需要对XAV939的在体实验进行更为充分的研究。

图5XAV939及其他药物对HBPDX生长的作用

注 PDX后随机分为对照及药物处理组：空白组，XAV939组(2 mg·kg-1，每天1次，腹腔注射)、顺铂组(3 mg·kg-1，每周1次，腹腔注射)及XAV939+顺铂组。本次药物实验为期24 d，至实验结束时，无小鼠异常死亡。A：小鼠体重，B：PDX肿瘤体积，C：PDX肿瘤试验终点时重量，D：小鼠血清AFP水平，E：本次药物实验分为空白对照组，顺铂组(3 mg·kg-1，5天1次，腹腔注射), 索拉非尼组(40 mg·kg-1，每天1次，经口喂养，连续喂养5天后改为2天1次)及瑞格菲尼组(20 mg·kg-1，每天1次，经口喂养)。本次药物实验为期15 d，至实验结束时，索拉非尼组小鼠死亡3只

Hippo和Wnt通路参与HB的发生发展由小鼠基因遗传数据所支持，因此这两条通路仍然被认为是HB的治疗靶点[10]。然而，对于TNKS1/2、AMOT家族蛋白和AXIN1，他们对HB发生的影响有待于用遗传模型进一步阐明。最后，通过本研究，可以证实PDX模型是一种可靠的临床前药物检测方法，可以用此模型进行HB靶向药物筛查。