TGF-β3基因多态性与亚洲人群非综合征型唇腭裂易感性的系统评价和Meta分析

陈 燕 芮海英 马恩惠 徐 涛 李旺阳 张益恒

非综合征型唇腭裂 (NSCL/P )是指不伴有其他先天畸形的唇腭裂，在世界范围内其发生率为1‰～2‰，是口腔科最常见的先天畸形[1]。NSCL/P可通过手术、牙科治疗、言语治疗和心理干预等方式来治疗[2]。NSCL/P是一种复杂的由多基因、多因素引起的疾病，目前认为是由遗传和环境因素交互作用所致的遗传疾病，其中易感基因的多态性变异是主要致病因素[3]。识别导致NSCL/P的关键基因是一个重大的挑战[4]。有研究表明转化生长因子-β3(TGF-β3)基因相关的突变可能增加NSCL/P的发病风险[5, 6]，但一些研究结果却表明二者不相关[7-9]。 为此，本文采用Meta分析定量评价TGF-β3基因多态性与NSCL/P易感性的相关性。

1 方法

1.1 文献纳入标准 同时满足以下条件：①TGF-β3基因多态性与NSCL/P的病例对照研究；②符合国内外公认的NSCL/P诊断标准的亚洲人群；③可以获取到本文Meta分析需测量指标；④对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)。

1.2 文献排除标准 病例报告、病例系列报告、会议摘要、综述。

1.3 文献检索策略

1.3.1 中英文检索词 转化生长因子β3，TGF β3,TGF-β3，基因多态性，单核苷酸,唇腭裂，腭裂，唇裂。

1.3.2 中文检索式 (转化生长因子β3[扩展全部数]/全部副主题词 OR TGF β3 ORTGF-β3) AND (唇裂[扩展全部数]/全部副主题词 OR 腭裂[扩展全部数]/全部副主题词 OR 唇腭裂) AND (多态性, 单核苷酸[扩展全部数]/全部副主题词 OR SNPs OR 基因多态性) 。

1.3.3 英文检索式 以PubMed为例， (“Transforming Growth Factor β3”[Mesh] OR TGF β3 [Title/Abstract] OR TGF-β3 [Title/Abstract]) AND (“cleft lip”[Mesh] OR “cleft palate”[Mesh] OR “cleft lip and palate” [Title/Abstract]) AND (“genetic polymorphism [Title/Abstract]” OR “single-nucleotide polymorphism” [Title/Abstract])。

计算机检索 PubMed、Cochrane Library、Embase、中文科技期刊全文数据库、中国期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库和万方数据库，检索时间自各数据库建库至2019年1月31日。

1.4 文献筛选和资料提取 2位研究者(陈燕，芮海英)独立阅读题目和摘要，根据排除标准初筛，初筛确定保留的文献根据纳入标准进一步阅读全文，如出现分歧讨论解决。2位研究者按照预先设计好的资料提取表独立完成信息提取并交叉核对，重复发表的文献选取近期发表的文献。

1.5 文献偏倚风险评价 采用NOS量表(Newcastle-Ottawa Scale)评价纳入文献的偏倚风险，7颗星为高质量研究[10]。

1.6 统计分析 应用Stata12.0软件进行Meta分析，并以OR及其95%CI表示效应量。采用Q检验和I2评估纳入研究间的异质性。若无统计学异质性(P>0.1，I2≤50%)，采用固定效应模型进行Meta分析；如果存在统计学异质性，则应用随机效应模型进行分析。计算各遗传模型的合并比值比及95%CI，包括等位基因模型(AvsG)、显性基因模型(GA+AAvsGG)、隐性基因模型(AAvsGG+GA)、相加模型(AAvsGG)及共显性模型(GAvsGG)。同时，基于基因型检测方法和对照来源进行亚组分析。通过逐项剔除单个研究来评估该研究对合并效应量的影响，敏感性分析采用剪补法，漏斗图不对称检查采用Harbord法。

2 结果

2.1 文献检索情况 图1显示，从数据库共获得相关文献125篇，去重后剩余文献86篇。通过阅读题目和摘要，排除文献64篇，22篇文献通过阅读全文进一步筛选，最终有9篇研究符合本文纳入和排除标准，806例NSCL/P患儿和781例健康对照儿童进入分析。纳入文献的基本特征见表1。

图1文献筛选流程图

表1 纳入文献的基本特征

注 HWE: Hardy-Weinberg equilibrium，AvsG：等位基因模型，GA+AAvsGG：显性基因模型，AAvsGG+GA：隐性基因模型，AAvsGG：相加模型，GAvsGG：共显性模型

2.2 纳入文献偏倚风险评价 表2显示，纳入的9篇文献，3篇研究[5,7,11]为高质量文献(7颗星)，6篇文献[6,8,9,11-14]为低质量文献(6颗星)。

2.3 Meta分析结果 图2～6显示，纳入研究间均无明显的统计学异质性，均采用固定效应模型进行统计分析。TGF-β3基因多态性Avs. G(OR=1.23, 95%CI：1.04～1.47)、AAvs. GG(OR=1.72, 95%CI：1.17～2.55)、GAvsGG(OR=1.50, 95%CI：1.15～1.98)和GA+AAvsGG(OR=1.50, 95%CI：1.16～1.94) 下与NSCL/P易感性有关；AAvsGA+ GG(OR=0.97, 95%CI：0.72～1.30)不相关。

表3显示，不同对照组人群来源亚组分析结果显示，对照组来源医院的人群，各基因模型差异均无统计学意义。对照来源社区人群，TGF-β3基因位点多态性AvsG、GAvsGG和GA+AAvsGG与NSCL/P易感性有关，AAvsGG和AAvsGG+GA不相关。不同基因检测分型方法亚组分析结果显示，采用PCR-RFLP法，各种基因模型下差异均无统计学意义。采用其他方法(PCR-SSCP和直接测序)，TGF-β3基因位点多态性AvsG、AAvsGG、GAvsGG和GA+AAvsGG与NSCL/P易感性有关，在AAvsGG不相关。

2.4 敏感性分析 表4显示，AvsG、GAvsGG、GAvsGG和AAvsGG+GA下，OR的点估计值和95%CI在剪补法前后合并效应量未见明显变化，提示结论是可靠的。AAvsGG+GA下，OR的点估计值和95%CI在剪补法前后合并效应量有明显变化，提示该结论不稳健。

2.5 发表偏倚分析 采用Harbord 加权线性回归法对发表偏倚进行量化分析，AvsG(P=0.896)、AA+GAvsGG(P=0.081)、AAvsGG+GA(P=0.117)、AAvsGG(P=0.423)4种模型差异无统计学意义，提示无明显的发表偏倚。GAvsGG(P=0.028)模型差异有统计学意义，提示存在发表偏倚的可能。

3 讨论

NSCL/P的发病机制尚未阐明，普遍认为NSCL/P的发生是环境和遗传基因交换作用的结果，多基因参与的具有遗传易感性的疾病，其中遗传因素可能发挥着重要的作用[15]，因此筛选NSCL/P的易感基因是当前研究的热点。许多基因和信号分子均参与了腭部发育过程，TGF-β3信号通路就是最重要的通路之一。TGF-β3基因位于人类 14q24，大小约为43 kb，含有 7 个外显子和6个内含子。研究表明，TGF-β3是一种多功能的生物活性调节因子，广泛调控细胞的增殖与分化、细胞迁移、机体的生长与发育、上皮间质转化、组织修复、基底膜降解等生理过程，具有重要的生物学功能[13]。还有研究提示，TGF-β3通过介导腭突中脊上皮基底膜的消失发挥作用，在腭板正常融合所需要的腭板中缝上皮细胞中呈特异性表达，对腮板中缝上皮细胞的融合及腭板中线的消失也起到作用[16]。动物实验结果表明TGF-β3突变的小鼠可出现鄂部不完全性融合最终导致腭裂, 但是额面部其他部位不会出现畸形[17]。理论上，TGF-β3基因位点多态性会影响其正常表达，可能会增加NSCL/P的患病风险。

表2 NOS量表评估

图2TGF-β3基因位点多态性与NSCL/P易感性的森林图(AvsG)

图3TGF-β3基因位点多态性与NSCL/P易感性的森林图(AAvs.GG)

图4TGF-β3基因位点多态性与NSCL/P易感性的森林图(GAvsGG)

图5TGF-β3基因位点多态性与NSCL/P易感性的森林图(GA+AAvsGG)

图6TGF-β3基因位点多态性与NSCL/P易感性的森林图(AAvs.GG+GA)

2003年，Kim等[18]于首次报道TGF-β3基因SfaNⅠ位点多态性与韩国人群NSCL/P易感性相关，其突变位点在TGF-β3基因第5个内含子104位，是由于该位点的腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)引起的。此后陆续有类似研究发表，2008年刘宁等[8]的研究中却指出TGF-β3基因的多态性与中国人群NSCL/P发病风险不相关。鉴于单个研究样本量小，论证强度低，且NSCL/P具有明显的遗传异质性，TGF-β3基因位点多态性是否增加亚洲人群NSCL/P的易感性，尚存在争议。本研究纳入9篇病例对照研究，Meta分析结果显示：AvsG、GA+AAvsGG、AAvsGG和GAvsGG模型均与NSCL/P易感性有关，而AAvsGG+GA模型差异无统计学意义。提示TGF-β3基因多态性增加亚洲人群NSCL/P的易感性。

表3 TGF-β3基因多态性与亚洲人群非综合征型唇腭裂患者的相关性的亚组分析结果[OR (95%CI)]

注 AvsG：等位基因模型，GA+AAvsGG：显性基因模型，AAvsGG+GA：隐性基因模型，AAvsGG：相加模型，GAvsGG：共显性模型；1)：PCR-RFLP和直接测序

表4 TGF-β3基因多态性与亚洲人群非综合征型唇腭裂患者的敏感性分析结果[OR (95%CI)]

注 AvsG：等位基因模型，GA+AAvsGG：显性基因模型，AAvsGG+GA：隐性基因模型，AAvsGG：相加模型，GAvsGG：共显性模型

本研究纳入的9篇研究，6篇文献来自中国，韩国[18]、日本和印度尼西亚[14]各1篇，由于基因分型方法不同，可能影响准确性，不同基因分型方法亚组结果显示，采用PCR-SSCP和直接侧序AvsG、AAvsGG、GAvsGG和GA+AAvsGG模型均与NSCL/P易感性有关，而采用PCR-RFLP法在各种基因模型差异均无统计学意义。不同基因检测方法下TGF-β3基因多态性与NSCL/P的易感性结论存在差异，提示基因检测方法可能是异质性的来源之一。以对照组人群来源(医院和社区)不同进行亚组分析，提示对照组的来源不同也可能是造成异质性的来源之一。

本研究局限性：①本研究纳入的6篇中国文献，亚洲其他国家的报道较少，亚洲人群代表性较差，且总体样本量不够大，Meta分析结论存在假阳性可能。②NSCL/P的病因非常复杂，不能从单个文献中提取环境因素、家族史等行亚组分析。③9篇文献患儿的基线数据存在差异，一定程度上会影响各研究的内在真实性。