5种含药材原粉的口服中药制剂微生物限度检查方法

王 玉，陈 彤

(徐州市中医院 制剂室，江苏 徐州 221009)

微生物检验和控制是保障中药制剂安全性的一项重要措施[1]。徐州市中医院拥有临床效果显著的自制中药制剂几十种，皆是由几种至几十种药材组成的复方制剂，有的清凉药材如蒲公英，其性苦寒，既能清解火热毒邪，又能泄降滞气，为清热解毒、消痈散结之佳品[2]。现代药理学研究表明：蒲公英不同提取物对沙门菌、金黄色葡萄球菌等5种菌具有明显的抑制作用[3]。所以，在微生物限度检查试验中，要考虑到中药材本身可能具有的抑菌作用，其会干扰真实的微生物污染的情况。2015 年版《中国药典》“微生物限度检查法”在检验内容、检验方法和培养体系上都有很大改变。因此，对本院的中药制剂需要按照2015药典四部通则微生物限度检查法进行重新验证。

2015年版药典对含药材原粉的口服固体制剂除了对需氧菌、霉菌和酵母菌提出标准要求外，还对控制菌提出以下要求：“每1 g固体制剂不得检出大肠埃希菌；每10 g固体制剂不得检出沙门菌；每1 g固体制剂耐胆盐革兰阴性菌应小于102cfu[4]”。本研究采用常规法、培养基稀释法和薄膜过滤法对5 种含药材原粉的中药制剂进行需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法验证，用常规法进行各制剂的控制菌检查方法验证，从而保证用药的安全性，以期为广大科研机构及医院药检室等部门的中药制剂微生物检查提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

FA1204B型分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ型生化培养箱、DHG-9143BS-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱、SYC-B型电热恒温调速振荡器，上海新苗医疗器械制造有限公司；YX-2800 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司。

1.1.2 供试中药制剂

健男春胶囊(批号：170609、170701和170724)，消痛散结片(批号：170511、170601和170623)，暖宫逐瘀丸(批号：170520、170613和170629)，清咽开音袋泡茶Ⅰ(批号：170505、170529和170611)，消食止泻散(批号：170428、170524和170613)，5种中药制剂均由徐州市中医院制剂室生产和提供。

1.1.3 测试溶液

1)培养基 胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA，批号：1704132)，胰酪大豆胨液体培养基(TSB，批号：20161216)，沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA，批号：170620)沙氏葡萄糖液体培养基(SDB，批号：20161125)，麦康凯液体培养基(批号：170315)，麦康凯琼脂培养基(批号：1703292)肠道菌增菌液体培养基(EE，批号：1511262)，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(XLD，批号：151214)，RV 沙门菌增菌液体培养基(批号：1511303)，紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(批号：1511242)，以上10种培养基均购于北京三药科技开发公司。

2)稀释液 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：160505)，购于北京三药科技开发公司。

3)菌株 金黄色葡萄球菌[菌株型号CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[菌株型号CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌[菌株型号CMCC(B)63501]、白色念珠菌[菌株型号CMCC(F)98001]、黑曲霉[菌株型号CMCC(F)98003]、乙型副伤寒沙门菌[菌株型号CMCC(B)50094]、大肠埃希菌[菌株型号CMCC(B)44102]，以上菌株均为第4代，购于南京茂捷生物科技有限公司。

1.1.4 试验菌液的制备和使用

试验菌液的制备和使用方法详见参考文献[4]。

1.2 常规法测定需氧菌、霉菌及酵母菌回收率

1.2.1 实验原理

采用2015版药典通则1105平皿法进行检测。

1.2.2 菌液的配制

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的新鲜培养物用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释制成500～1 000 cfu/mL的菌悬液备用。取黑曲霉的新鲜培养物，加入5 mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的稀释液，将孢子洗脱，将其悬液转移至无菌试管中，制成500～1 000 cfu/mL 的菌悬液菌液备用[4-5]。

1.2.3 供试液的配制

精确量取各供试中药制剂10 g，分别加入稀释液100 mL(1∶ 10)，45 ℃振荡，分散均匀，制成供试液备用。

1.2.4 各实验组的配制

试验组：取1 mL供试液和0.1 mL试验菌悬液，混匀后，分别加至无菌平皿中，加入适量的TSA或者SDA，每组平行制备2个平皿，按平皿法测定菌落数。试验重复3次。其中TSA用来需氧菌的计数；SDA用来霉菌和酵母菌的计数。

供试品对照组：取1 mL供试液，按平皿法测定供试品本底菌数。

菌液对照组：取0.1 mL试验菌悬液与1 mL稀释液混匀，加至无菌平皿中，按照试验组方法进行测定。

阴性对照组：取稀释液1 mL 分别注入无菌平皿中，作阴性对照组。

1.2.5 结果判断

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2.0。

1.3 培养基稀释法测定需氧菌、霉菌及酵母菌回收率

1.3.1 实验原理

培养基稀释法是将供试液中加入较大量的培养基，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。

1.3.2 各实验组的配制

试验组：取0.1 mL试验菌悬液至10 mL供试液中，其他操作与常规法相同。

供试品对照组：取0.2 mL供试液，只加入稀释液，按试验组操作。

菌液组：取0.2 mL试验菌悬液加至无菌平皿中，倒入适量培养基，测定菌落数。

阴性对照组：将0.2 mL稀释液加至无菌平皿中，倒入适量培养基，作为阴性对照组。

1.3.3 结果判断

实验结果的判断同1.2.5节中的方法。

1.4 薄膜过滤法测定需氧菌、霉菌及酵母菌回收率

1.4.1 实验原理

微孔滤膜可以对细菌进行有效的拦截，薄膜过滤法在药品的微生物限度检验时可顺利去除药物中所含抑菌成分[6]。

1.4.2 各实验组的配制

试验组：取供试液1 mL 与适量的稀释液混匀，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，滤膜用适量缓冲液冲洗3次，第3次冲洗时加入0.1 mL试验菌液，冲洗完成之后，将滤膜菌面向上，贴附琼脂培养基表面，培养结束，测定菌落数。

供试品对照组：按试验组操作，最后一次冲洗不加试验菌。

菌液组：用稀释液替代供试液，其他同试验组操作。

阴性对照组：稀释液代替供试品，不加阳性菌液，其他操作同试验组。

1.4.3 结果判断

实验结果的判断同1.2.5节中的方法。

1.5 控制菌检查方法的验证

1.5.1 各实验组配制

1)大肠埃希菌：取0.1 mL大肠埃希菌液与10 ml按1.2.2节各供试液混匀，移至100 mL TSB中，32 ℃培养1 d，量取1 mL与100 mL麦康凯液体培养基混匀，42 ℃培养2 d。然后采用划线接种法接种至麦康凯琼脂培养基平板上，32 ℃培养2 d。

2)沙门菌：取各供试中药制剂10 g至200 mL TSB中，分散均匀成供试液。取0.1 mL沙门菌液与上述供试液混匀，置32 ℃培养1 d，量取0.2 mL与20 mL RV 沙门菌增菌液体培养基混匀，32 ℃培养2 d后，划线接种至XLD平板上，32 ℃培养2 d。

3)铜绿假单胞菌：取各供试中药制剂10 g至100 mL TSB中，分散均匀成供试液。取0.1 mL的铜绿假单胞菌悬液与上述供试液混匀后，加至10 mL EE中，32 ℃培养2 d，采用划线接种法接种至紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上，32 ℃培养2 d。

阳性对照组：稀释液代替供试液，按上述操作。

阴性对照组：稀释液代替供试液，不加菌液，按上述操作。

1.5.2 结果判断

若培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为控制菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判定供试品未检出控制菌。

2 结果和讨论

2.1 常规法验证5种含药材原粉的中药制剂对各试验菌株的回收比值

根据常规法检测的试验结果，计算各试验菌株的比值，结果见表1。由表1可知：健男春胶囊、暖宫逐瘀丸和消食止泻散对各试验菌的回收比值均为0.5～2.0，符合《中国药典》2015版四部通则的回收率规定，可用常规法进行微生物限度检查。而消痛散结片与清咽开音袋泡茶Ⅰ的回收比值小于0.5，说明这2种中药制剂皆具有一定的抑菌性，须重新验证。

2.2 培养基稀释法验证消痛散结片与清咽开音袋泡茶Ⅰ对各试验菌株的回收比值

消痛散结片能行气活血，软坚散结，临床用于肝郁痰凝、瘀血肿块、乳癖、瘿瘤和脂瘤等症。其方中含有三棱、青皮、柴胡、海藻和煅牡蛎等，有文献研究指出：柴胡水提物对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用[7]，海藻所含有的间苯三酚具有抗金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌活性[8]。根据本研究中培养基稀释法检测的试验结果，计算各试验菌株的比值，结果见表2。由表2可知：消痛散结片对各试验菌的回收比值均为0.5～2.0，符合标准规定。结果表明采用培养基稀释法，可消除消痛散结片的抑菌性，可用来对消痛散结片的微生物检查验证。而清咽开音袋泡茶Ⅰ的需氧菌回收比值小于0.5，不符合相关规定，所以清咽开音袋泡茶Ⅰ仍需采用薄膜过滤法进行验证。

表1 常规法检查需氧菌、霉菌及酵母菌的回收比值

表2 培养基稀释法检查需氧菌、霉菌及酵母菌回收比值

2.3 薄膜过滤法验证清咽开音袋泡茶Ⅰ对各试验菌株的回收比值

清咽开音袋泡茶Ⅰ由薄荷、金银花、胖大海、浙贝母和黄芩等十味药组成，具有清热消肿，利咽开音功效，可用于急、慢性咽喉炎。其中薄荷提取物，尤其是薄荷精油枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制效果[9]、金银花提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌作用[10-11]、黄芩也被多次报道对各种细菌具有很强的抑制作用[12]。根据薄膜过滤法试验结果，计算出各试验菌株的回收比值，需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值见表3。由表3可知：清咽开音袋泡茶Ⅰ采用薄膜过滤法5 种菌种的回收比值均在0.5～2.0，其本身的抑菌作用可以通过薄膜过滤法消除。

2.4 控制菌检查方法验证

对文中所选的5种含药材原粉的中药制剂的控制菌检查结果见表4。由表4可知：试验组和阳性对照组能正常检出控制菌，阴性对照未检出，5种供试品对控制菌无明显抑制作用，所以该方法可用来对这5种口服中药制剂进行控制菌检查。

表3 薄膜过滤法检查需氧菌、霉菌及酵母菌回收比值

表4 控制菌检查方法验证

注：+表示有抑菌作用；-表示无抑菌作用。

3 结论

我院中药制剂多为含有多种中药组成成分的复方制剂，必须经过验证，采取合适的试验方法去除制剂本身的抑菌作用，才能真实反映制剂的微生物污染情况。根据本研究试验结果表明：

1)健男春胶囊、暖宫逐瘀丸和消食止泻散属于无明显抑菌作用的制剂，可以采用常规法检查微生物限度。消痛散结片本身具有明显的抑菌作用，本研究结果还表明：消痛散结片的抑菌作用可以通过培养基稀释法消除，培养基稀释法适合作为其微生物限度检查手段。而清咽开音袋泡茶 Ⅰ 由于组方成分及特性，具有很强的抑菌作用，采用培养基过滤法时并不能消除这一作用，而选用薄膜过滤法能有效消除清咽开音袋泡茶Ⅰ抑菌作用，各阳性菌回收比值均为0.5～2.0，符合2015版药典的规定。因此薄膜过滤法适合作为清咽开音袋泡茶Ⅰ的微生物限度检查方法。根据本文的控制菌检查结果显示5种中药制剂对控制菌无明显抑制作用，所以常规法可用来对这5种口服中药制剂进行控制菌检查。

2)通过微生物计数回收验证试验，能有效地消除中药制剂的抑菌作用，保证试验结果的准确性及科学性。作为制剂质量控制人员应重视微生物计数方法的适用性，提高专业素质，加强质量控制，认真做好制剂卫生检查工作，以确保人民群众用药的安全性、有效性。