贵州绿茶滋味物质的浸出特征及三维荧光指纹图谱分析

王加真，金 星，万 雪

（遵义师范学院a.生物与农业科技学院；b.物理与电子科学学院，贵州遵义563006）

茶是世界三大饮料之一，具有一定的药用价值， 其丰富的生物活性物质，如茶多酚、茶氨酸和多糖等，能够对人体起到保健作用，在降低血压、血脂及增强免疫力等方面有一定的作用[1,2]。泡茶是国人的智慧结晶，泡茶的本质是茶叶中主要内含物及功能物质在茶汤中溶解、释放出色、香、味的过程[3,4]。绿茶中茶多酚、氨基酸、咖啡碱是主要的呈味物质，这三大内含物质溶于水后的浓度及比例，直接影响到茶汤的口感[4]，茶叶因利用方式的差异导致内含的药理活性成分含量差异较大[5]。绿茶在冲泡过程中，一道茶汤香气浓郁，滋味鲜爽；二道茶汤虽浓郁，但鲜爽味不如前，三道茶汤香气和滋味已淡，再冲泡已无滋味。

抹茶是经过特殊栽培的茶树鲜叶加工为茶叶后经过研磨工艺而成的微粉状茶产品[6]，利用方式以食用为主，国标对茶叶品质的测定采用的是将完整茶叶研磨成微粉状后煮茶的方法，等同于对抹茶品质的测定。泡茶和煮茶对茶叶内含物的浸出规律是否一致，研究泡茶过程中每道茶汤内含物质的浸出动态，对科学指导人们泡茶、饮茶，最大程度发挥茶叶功效具有重要的现实意义。三维荧光光谱技术能同时提供荧光强度与激发和发射波长的关系，完整表达物质特有的三维荧光指纹图谱，可完成混合成分的定性、定量分析，广泛用于水质、食品安全及茶叶化学成分检测[7-10]。

本文旨在探究绿茶茶粉煮茶与整叶泡茶的本质区别，及其在冲泡过程中的品质变化规律，通过建立不同泡茶次数茶汤的三维等高指纹图谱，结合茶汤色素、茶多酚、氨基酸、咖啡碱含量的动态变化，实现对绿茶冲泡过程中浸出内含物的具体量化，为科学、健康饮茶，以及绿茶的综合利用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

贵州毛峰茶由贵州湄潭县栗香茶业有限公司提供，系福鼎大白茶一芽三叶加工的成品。酒石酸铁（分析纯）、无水茚三酮（分析纯）、三氯化铝（分析纯）、硫酸、盐酸、咖啡碱（分析纯）均购买自国药集团化学试剂有限公司，实验用水为超纯水。

1.2 仪器

F97PRO荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司，配备1cm石英池；MINI-SPIN高速离心机，德国Eppendorf公司；UV-9000S紫外可见光光度计，上海元析仪器有限公司；GB204电子天平（感量0.1mg）瑞士METTLERTIKEDO;KQ-250B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 样品处理及测定

（1）茶粉煮茶茶汤的制备

茶叶经研磨粉碎后过100目筛，准确称量1.0000克，加入100ml蒸馏水后在100℃水浴中浸提45min,静置24h，吸取上清液。

（2）茶叶泡茶茶汤的制备

按照国人的饮茶习惯，茶叶用量3.000克，投入200ml沸水中，盖好盖，10分钟后将茶汤倒出，为第一道茶汤，继续上述步骤得到第二道茶汤和第三道茶汤，泡茶过程中，留出一道残茶、二道残茶、三道残茶在烘箱内烘干水分后进行茶粉煮茶茶汤的制备。每个样品重复3次。

（3）茶汤三维荧光光谱测试条件：光源为150W氙灯，激发波长（Ex）范围为300～750nm，发射波长（Em）范围为300～750nm，递增1.0nm，5.0nm狭缝，灵敏度为900V，扫描速度60nm/min，以扫描3次光谱数据平均值作为数据采集值。利用PROLAB软件（V.6.5.0.2965）进行三维荧光光谱的采集和分析。

（4）茶叶水浸出物、游离氨基酸、茶多酚、咖啡碱、花黄素的测定均采用国标法[11]。

1.4 数据统计与分析

试验中茶叶品质指标均为3次平行，结果以平均值±标准差（means±SD）表示。采用SPSS 10.0软件进行相关数据的统计分析，以P〈0.01为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 绿茶不同处理方式下茶汤的三维荧光谱

荧光光谱反映了包含共轭双键的分子信息，酚酸、黄烷酮是茶汤中含量较高的荧光分子。实验结果表明，煮茶和泡茶后的茶汤的三维荧光光谱都会产生明显的瑞利散射（图1中的条带状），煮茶后的茶汤的瑞利散射最为明显，随着泡茶次数的增加，瑞利散射有减弱的趋势。瑞利散射是指当粒子尺寸远小于入射光波长时各方向上散射光强度不一致的光学现象。瑞利散射现象的存在说明茶汤中存在粒径尺寸远小于光波波长的物质。相对于泡茶后的茶汤，煮茶前对茶叶进行了粉碎且长时间的沸水浸提处理，煮茶的茶汤中含有更多粒径较小的物质，更容易产生瑞利散射。

与煮茶茶汤的光谱图相比，泡茶茶汤的荧光特征峰明显减少，在679nm发射波长下仅第一道茶汤有较弱的荧光峰。煮茶后的茶汤在679nm发射波长下有5个荧光峰，激发波长分别为420～425、507、540、610、660nm,其中在 425 和 660nm 处有强峰，其他三个波长处为弱峰。

茶汤中茶多酚含量最为丰富，茶多酚是一类分子量大小不同，极性和结构各异的多酚类衍生物的复杂混合体，主要包括黄烷醇类、黄酮及黄酮醇类、花色素类、酚酸及缩酚酸类等四大类组成物质，主要成分为儿茶素，茶多酚水溶液主要有3个荧光峰位，I区210nm/315nm、270nm/315nm、Ⅱ区335nm/396nm和Ⅲ区490nm/515nm[12]。本研究中的荧光峰2对应茶多酚可见光区（490/515nm）的荧光峰，推测可能是儿茶素对应的荧光峰，荧光峰1位于395-400nm/456-461nm，与上述三个区无对应。本研究表明，茶多酚最大荧光峰值的波长会随溶剂极性的增大及形成氢键能力的增强而发生红移。茶多酚的荧光峰位分别红移至可见光395-400nm/456-461nm和490nm/515nm处。水溶液可形成分子间氢键，作为质子转移的通道，荧光峰向长波长方向移动，利于茶多酚可见光区的荧光发射。文献报道，黄酮醇的最大激发波长为 352-382nm，异黄酮的最大激发波长为334-339nm，二羟基黄酮的Ex/Em=332nm/420nm，湄潭毛峰茶汤1号峰的Ex/Em=395-400nm/456-461nm，可以推断1号峰为黄酮及黄酮醇类的荧光峰，峰位的偏移可能是多种黄酮类物质复合作用的结果。3号峰仅在煮茶后的茶汤及泡茶的一道茶汤中有显示，煮茶后的茶汤极为明显，荧光峰值达1658，一道茶汤的荧光峰值仅为47.18。茶叶中含有一定量的色素，叶绿素及类胡萝卜素为脂溶性色素，冲泡过程中仅有极少量浸出，但茶叶经过粉碎、长时间沸水浸提后，叶绿素体膜被破坏，叶绿素分散到水分子空隙中。光合色素具有荧光现象，叶绿素a的荧光光谱，其 Ex/Em=410nm/674nm，3 号峰 Ex/Em=420，425nm/676nm与叶绿素a的荧光光谱基本吻合，最大激发波长存在一定红移现象。叶绿素分子有红光和蓝光两个最强吸收区，在煮茶茶汤中分别对应3号和7号峰，7号峰Ex/Em=660nm/676nm，叶绿素b在红光区有最大吸收，可以推测7号峰为叶绿素b的荧光光谱。4、5、6号峰与3、7号峰有共同的发射波长676nm，可能是一些其他色素类的荧光光谱。煮茶的茶汤各峰强度之和为8743，泡茶一道茶汤各峰强度之和为3371，泡茶二道茶汤各峰强度之和为2575，泡茶三道茶汤各峰强度之和为2035。从泡茶不同次数的茶汤荧光峰强度差异可以判定，不同泡茶次数茶汤中所含化学物质总体一致，相同物质含量的不同反映出不同冲泡次数茶汤中化学物质含量存在差别。

2.2 荧光光谱特性数据

图1 绿茶不同处理后茶汤的三维荧光光谱

2.3 荧光峰分布规律及强度变化规律

表1 不同处理下茶汤的荧光特征峰及其强度

表2 不同处理下绿茶汤中滋味成分的含量变化

2.4 不同处理方式绿茶汤中滋味成分的变化

同行数据肩标不同大写字母（煮茶处理间）、小写字母（泡茶处理间）表示差异极显著（P〈0.01）。

贵州绿茶以“翡翠绿、嫩栗香、浓爽味”为特征，泡茶讲究沸水，多投茶。实验中用到的湄潭毛峰系用小叶种的福鼎大白茶在春季加工而成，加工时有揉捻的工艺，成茶水浸出物高达48.27%，且具有氨基酸和茶多酚含量高，酚氨比低的特点，是耐冲泡的高品质绿茶。古人对茶叶的利用采取混煮羮饮的方法，即食用的方式，本研究表明，茶粉煮茶与茶叶泡茶对茶叶滋味物质的浸出区别很大，泡茶三次总共浸出的滋味物质占茶叶粉碎后煮出量比例大小依次为花黄素69.79%、氨基酸10.66%、咖啡碱10.12%、茶多酚7.43%，这说明除了花黄素能通过泡茶的方式被人体充分利用，其它的滋味物质泡茶后还有大量留在残茶中，仅有少量被人体利用。茶叶冲泡后的残茶仍含有大量的功能成分，以三道残茶为例，茶多酚含量为 14.362±0.45%，咖啡碱含量为 1.34±0.073%。游离氨基酸为0.362±0.024%，因此，泡茶后的残茶仍具有很高的利用价值，为充分利用茶叶功能物质，应参照抹茶，探索茶叶食用的方式。当下的绿茶饮茶方式是沸水冲泡，基本是三泡，茶叶随着泡茶次数的增加，茶汤中酚氨比值呈增加趋势，一道茶酚氨比6.05，茶汤滋味鲜爽，二道茶酚氨比16.9，茶汤滋味仍浓郁，三道茶酚氨比30，茶汤滋味变淡。可见与茶多酚相比，游离氨基酸在茶汤中的浸出量下降趋势更明显。

3 结论

本文测定了不同煮泡处理对茶汤及残茶中游离氨基酸、茶多酚、咖啡碱、花黄素含量的影响，并通过三维荧光指纹图谱技术对冲泡过程中各营养成分随冲泡次数变化的规律进行了探究，得到以下结论：

（1）茶叶粉碎后煮茶方式能最大程度利用茶叶滋味物质，湄潭毛峰采用粉碎后沸水煮样测得的品质数据最高，水浸出物含量高达48.27%，游离氨基酸1.81%，茶多酚22.76%，咖啡碱2.45%，花黄素3.47%；与茶多酚和咖啡碱相比，泡茶次数对游离氨基酸影响最大，茶汤中酚氨比的大幅上升是引起茶滋味变淡的直接因素，三泡后的残茶中仍有丰富的茶多酚、咖啡碱，泡茶后的残茶仍具有极大的利用价值，应加强对传统泡茶方式产生的残茶的开发利用。

（2）煮茶和泡茶条件下，湄潭毛峰茶汤三维荧光光谱图中均含有两个明显的荧光峰（F1和F2），它们所在位置的激发波长和发射波长 Ex/Em范围分别为490nm/515nm和395-400nm/456-461nm，可以判定茶汤中的多酚物质是产生荧光的主要物质，F1为黄酮及黄酮醇类物质的荧光峰，F2为儿茶素类物质。

（3）煮茶条件下，茶汤叶绿素荧光现象明显，叶绿素A荧光强度为1658，泡茶第一道茶有微弱的叶绿素A荧光现象，荧光强度仅为47.18；研磨后的茶叶经过长时间的沸水浸提后，在676nm发射波长下产生一系列的激发荧光峰，分别位于420nm（F3）、507nm（F4）、540nm（F5）、610nm（F6）、660nm（F7）。其原因为：在煮茶过程中，茶叶中的叶绿体膜被破坏，细胞成为全透性的，色素分子扩散到水分子的间隙中，产生较强的荧光现象。