NK细胞体外培养及对HepG2细胞的杀伤活性研究*

韩光宇 周忠海 张 巍 任思坡 谭 昆

1 江苏省徐州市医学科学研究所 221006；2 解放军第九七医院；3 徐州市急救医疗中心

NK细胞又称自然杀伤细胞，是一类CD3-TCR-的大颗粒淋巴细胞，是执行非MHC限制性杀伤功能的主要细胞，也是体内天然防御功能中的重要组分。NK细胞无须抗原刺激，可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，在机体免疫监视和早期抗感染和免疫过程中起重要作用[1]。NK细胞来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓及胸腺微环境，占淋巴细胞总数的9%～25%[2]，本研究通过体外培养将单个核细胞培养为NK细胞并观察对HepG2细胞的杀伤活性。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 HepG2细胞株(中国科学院上海细胞库)；NK细胞培养基(CellGroRGMP SCGM)；IL-2(沈阳三生制药)，胎牛血清(GIBCO)；异硫氰酸荧光素(FITC-CD3)、别藻青蛋白(APC-CD56)、藻红蛋白(PE -CD107a)、穿孔素、颗粒酶B和破膜剂(eBioscience，美国)。淋巴细胞分离液(天津灏洋)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，CO2培养箱(美国Thermo)。大容量低速水平离心机(美国Beckman-Clouter)，倒置显微镜(浙江永新)，酶标仪(上海科华实验系统有限公司)等。无血清培养基(日本TAKARA GT551 H3)

1.2 实验样本 采集外周血约20ml，肝素抗凝。

1.3 实验方法

1.3.1 NK细胞培养：将抗凝外周血用生理盐水1∶1稀释，将稀释液小心平铺到淋巴细胞分离液上层。2 000r/min离心20min，吸取白膜层，生理盐水洗涤3次，去上清，将细胞用NK培养基重悬调整细胞密度1×106/ml，补加IL-2 200U/ml接种于6孔培养板，每孔2ml，5%CO2、37℃培养箱中培养，每日观察细胞形态及生长情况，及时换液和补充培养基，收集培养12d的贴壁细胞进行细胞表面标志物检测和相关实验。

1.3.2 HepG2细胞株培养：HepG2细胞株置于GT551 H3培养基中， 5%CO2、37℃条件下扩增培养，取对数生长期的贴壁细胞进行相关试验。

1.3.3 NK细胞表型检测：以FITC-CD3、APC-CD56与培养第12天的NK细胞及未培养的细胞(细胞密度5×106/ml)避光孵育15min，用流式细胞术进行表型检测。

1.3.4 NK细胞分泌细胞毒颗粒水平检测：收集培养第12天的NK细胞加入FITC-CD3、APC-CD56、PE-CD107a，破膜剂、穿孔素、颗粒酶B，用流式细胞术检测其表达水平。

1.3.5 LDH释放法测定细胞杀伤活性：取对数生长期的HepG2细胞用含10%FCS的RPMI1640调整细胞密度为2×105/ml，在96孔培养板中，每孔加100μl靶细胞，其中靶细胞自然释放孔不加效应细胞，只加100μl培养液；效应细胞孔不加靶细胞只加100μl培养液；最大释放孔加100μl 1%NP40；实验孔分别按5∶1、10∶1、20∶1的效靶比加入效应细胞NK细胞100μl，每种均做3个复孔，37℃、5%CO2培养4～6h，加入显色反应体系，490nm波长(参考波长650nm)测定其吸光度A值，按照LDH释放法计算杀伤活性：杀伤活性(%)=[(实验组A值-总自然释放A值)/(最大释放组A值-总自然释放A值)]×100%。

2 结果

2.1 NK细胞形态学观察和表型检测 培养第0天细胞体积小，镜下多散在，圆形透亮，在NK培养基中培养24h即可见贴壁生长，2～3d后细胞聚集，成簇状克隆样生长；体积变大呈多形性，异质性明显。流式细胞术检测结果显示，第0天(培养前)的PBMC 细胞CD3-CD56+阳性率为(14.2±5.1)%，而培养12d的NK细胞CD3-CD56+阳性率(73.6±11.3)%，差异有统计学意义(P<0.001)

2.2 NK细胞分泌细胞毒颗粒水平检测 经流式细胞仪检测，其穿孔素、颗粒酶B、CD107a的表达水平分别为(75.5±10.9)%、(62.2±8.9)%、(63.9±10.5)%。

2.3 NK细胞毒活性测定 效靶比为5∶1、10∶1、20∶1时，NK细胞对HepG2对杀伤率分别为(23.1±2.4)%、(35.6±3.1)%、(58.3±5.2)% ，随效靶比增加，杀伤活性增强(P<0.05)。

3 讨论

NK细胞来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓及胸腺微环境，其表面标志主要有CD3、CD56、CD16等。通常情况下，体内的NK细胞多处于休眠状态，信号因子激活后，NK细胞无须抗原刺激和MHC的限制可非特异直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，构成了机体第一道免疫杀伤防线[3]。研究证实肿瘤患者体内NK细胞数量减少、功能异常，不能正常发挥作用是导致肿瘤免疫逃逸的重要机制[4]。

NK细胞具有细胞介导的细胞毒作用，无须抗原刺激可直接杀伤靶细胞，对肿瘤的增殖和转移扩散具有抑制作用，可清除术后微小残留病灶、降低复发，被认为是肿瘤免疫治疗的重要免疫细胞[5]。因此，如何获得高纯度、大剂量的NK 细胞成为NK 细胞应用最为关键的问题之一。不同的扩增方案和不同的抗凝剂会对NK细胞的增殖产生影响。IL-2具有激活NK细胞，促进NK细胞分化和产生细胞因子的能力，因此体外培养时在NK培养基中加入IL-2可促进NK细胞增殖[6-7]。

活化的 NK细胞发挥调节免疫以及直接杀伤靶细胞的作用，成为近年来免疫治疗研究的热点。NK细胞受触发信号激活后，首先通过脱颗粒过程释放穿孔素和颗粒酶B到达靶细胞，穿孔素通过在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，介导颗粒酶B进入靶细胞，颗粒酶B是NK细胞颗粒中重要的丝氨酸蛋白酶，它通过激活Caspase级联反应，引起靶细胞遗传物质DNA的断裂，导致靶细胞凋亡，CD107a可能与NK细胞活化及脱颗粒有关[8]。此外，NK细胞还分泌多种细胞因子，如TNF-α和IFN-γ以及趋化因子，参与刺激和激活适应性免疫反应。有研究认为NK细胞活化后，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和Fas配体(FasL)在NK细胞表面上调，也可以通过刺激靶细胞表面表达的死亡受体来杀死靶细胞，并且诱导靶细胞凋亡[9]。本研究结果显示培养的NK细胞对HepG2细胞有明显的杀伤活性，可能与上述杀伤机制有关，有待进一步研究。

《2016年临床癌症进展：ASCO 癌症研究进展年报》肯定了免疫治疗在癌症治疗领域的革命性进展[10]。免疫治疗如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)回输治疗能提高肝癌患者的无复发生存率、总生存率，并显示了良好的安全性[11]。NK细胞作为肿瘤免疫治疗重要的效应细胞，临床研究已经证实了NK细胞在包括肝癌的实体瘤过继免疫治疗中的疗效[12]。通过本实验，NK细胞可在体外大量培养，对肝癌细胞的杀伤活性随效靶比的增加而增强，为临床研究和应用奠定了实验基础。