不同日龄新生SD大鼠坏死性小肠结肠炎模型建立

潘兆军, 田兆方, 武 荣

(1. 南京医科大学附属淮安第一医院新生儿科, 淮安 223002；2. 淮安市妇幼保健院新生儿医学中心, 淮安 223002)

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是早产儿胃肠疾病死亡的主要原因，随着新生儿救治技术的提高，极低及超低出生体质量婴儿生存率不断提高，但NEC发病率及相关的死亡率并未下降。据不完全统计，出生体质量低于1500 g的早产儿，NEC发病率在10%左右，死亡率在20%～30%，并且随着疾病严重程度呈上升趋势[1-3]。到目前为止，NEC的病理生理学机制仍未完全阐明，但已经确定了早产、细菌定植、肠内营养和不成熟的免疫系统等几个危险因素[4]。大多数现有的NEC动物模型都没有在实验中考虑早产因素。刚出生的大鼠肠道隐窝和绒毛发育相当于人类22周的孕龄[5]，而人类NEC多发生于孕龄低于32周的早产儿，可以模拟人类NEC发病时期建立充分表征的NEC模型，对探讨NEC的发病机制及有效的预防治疗措施具有重要价值。本实验在目前相关研究现状基础上，对出生后不同日龄的新生大鼠，通过人工喂养、缺氧、冷刺激及LPS胃内注入等方法建立NEC大鼠模型，并对两者进行比较以探索适宜的NEC模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

妊娠18 d SPF级SD大鼠6只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2013-0016], 饲养于南京医科大学附属淮安第一医院动物实验中心[SYXK(苏)2018-0012]。选取出生2 h及48 h SD大鼠各24只，按体质量大小编号，2个时点再随机分为人工喂养组(A、B组）、人工喂养+脂多糖(LPS)组(C、D组)、对照组(E、F组)，即2 h的A、C、E组及48 h的B、D、F组，每个亚组8只小鼠。

1.2 主要试剂及仪器

低出生体质量婴儿配方奶粉(超级能恩)购自雀巢公司； 脂肪乳注射液(C6-C24)购自华瑞制药有限公司； 蛋白质粉购自汤臣倍健公司； LPS(E.coli055：B5)购自美国Sigma公司； 胃管由24G静脉留置针导管改装； TED-60T测氧仪购自美国Teledyne公司； 保育箱为戴维YP-90A婴儿保育箱； 缺氧箱由戴维无接触输氧头罩改装； 37 ℃恒温水浴箱购自上海医疗器械厂, 4 ℃冰箱购自青岛海尔电器有限公司。

1.3 鼠乳配方奶配置步骤

参照参考文献[6]称取早产儿配方奶5 g、蛋白粉8 g，脂肪乳(C6-C24)50 mL，加入约80 ℃灭菌注射用水自100 mL，使用玻璃棒充分混匀，总热量为617.4 kJ。

1.4 造模流程

A组采用24G静脉置留置针定时经口插管喂养，第1日按0.1 mL/3 h给予，随后每24 h增加0.05 mL；B组人工喂养第1日按0.15 mL/3 h给予，随后每24 h增加0.05 mL。C组、D组分别在A组、B组基础上每日加用LPS 10 mg/kg(2 mg/mL稀释于灭菌水中)1次，经胃内注入，连续3次。LPS灌胃时的配方奶喂养量=需奶量-LPS量-胃残奶量。E、F组：仅由母鼠母乳喂养。

1.5 缺氧及冷刺激流程

打开缺氧箱中的纯氮气筒流量表，控制氮气流量为15 L/min, 当缺氧箱氧浓度为零时开始计时,置入实验大鼠，持续90 s后，随后将其置入冰箱冷藏室中，保持环境温度4 ℃，持续10 min，结束后放回保育箱，每12 h进行1次缺氧+冷刺激，共6次。

1.6 处理

观察大鼠活动情况，所有大鼠试验前和试验后同一时间称重，并进行记录。所有实验大鼠均于相应实验时点的84 h空腹断头处死大鼠，打开腹腔取出取回盲部近端肠管1 cm置于体积分数10%甲醛溶液中固定，取冠状切面，HE染色，光学显微镜下进行肠道组织病理评分。

1.7 肠道组织病理评分

肠道组织病理评分参考文献[7]，由不参与本实验项目的扬州大学医学院附属淮安市妇幼保健院病理科二位中级以上职称人员进行双盲法评分，评分标准如下，0分：肠黏膜绒毛完整，组织结构正常；1分：轻微黏膜下和(或)固有层肿胀分离；2分：中度黏膜下和(或)固有层分离，黏膜下和(或)肌层水肿；3分：重度黏膜下和(或)固有层分离，黏膜下和(或) 肌层水肿，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴肠坏死。病理评分≥2分者视为NEC造模成功。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 一般状态及存活情况

造模后，A、C组大鼠8～12 h相继出现不同程度排黄绿色黏液稀便、腹胀、体质量减轻，随后出现胃潴留、呕吐、嗜睡，常蜷缩而卧、抱团反应消失、活动度下降、反应迟钝, 且逐渐加重。B、D组大鼠在实验开始后12 h内即出现主动活动减少，对外界刺激反应减缓，均出现不同程度出现腹胀和胃潴留的症状, 伴有排黄绿色甚至黑色稀便等大便性状的改变，并出现生长缓慢或体质量不增, 以D组大鼠症状为重。造模期内A组大鼠死亡2只，C组死亡3只，B、D组各有1只死亡, 6组动物死亡率分别为25%、12.5%、37.5%、12.5%、0、0。E、F组大鼠生长发育无明显异常，体质量增长稳定，主动活动及对外界刺激反应良好，进食及排便正常，无消化道异常表现。各组大鼠体质量增长情况见表1。

2.3 肠道组织病理学观察

早期人工喂养A组(图1A1、A2)、C组(图1C1、C2)回盲部肠道组织坏死严重，肠壁绒毛大部分脱落坏死，腺体排列紊乱消失，固有层与黏膜下层重度水肿，部分样本肠绒毛消失伴肠坏死。晚期喂养B组(图1B1、B2)、D组(图1D1、D2)肠黏膜下部分和固有层分离，肌层变薄甚至断裂，肠壁绒毛部分脱落坏死，黏腺体结构紊乱，部分肠管可见肠壁积气。正常对照E组(图1E1、E2)、F组(图1F1、F2)新生鼠的肠道结构完整，组织结构清晰正常。上皮完整连续，腺体排列规则，绒毛高耸整齐，黏膜层、黏膜下层、固有层无充血水肿。死亡大鼠尸检见腹胀明显、部分有明显腹水，肠道扩张，迂曲，颜色呈黄绿色或暗紫色，部分为黑色，肠壁积气，符合NEC病理改变。

表1 大鼠体质量比较 g

2.4 肠道组织病理评分

2 h大鼠组肠道病理积分组间差异有统计学意义(F=47.41，P=0.000)，48 h大鼠组组间差异也有统计学意义(F=31.89，P=0.000)。详见表2。

2.5 NEC的发生率

A、B、C、D、F、F组存活大鼠NEC发生率分别为100%(6/6)、85.71%(6/7)、100%(5/5)、100%(7/7)、0(0/8)和 0(0/8)。A、B、C、D 组NEC发生率比较差异无统计学意义。

3 讨论

自从1974年Barlow等[8]利用配方奶人工喂养、缺氧成功建立新生大鼠NEC模型后，此后大部分学者以此为基础运用人工喂养、缺氧冷刺激来建立模型[9-12]。国内亦有通过腹腔注射LPS建立NEC模型，所致模型全身炎症重而肠道反应轻[13]。李美雪等[14]应用人工喂养和LPS灌胃成功建立NEC大鼠模型，该方法需要30 mg/kg以上的LPS方可诱导出典型病理改变的NEC模型，并可诱发肝、肺等脏器严重充血坏死。本实验结合NEC的病因和机制[15]，参考不同胎龄NEC发病情况，选择出生2 h以及48 h(2日龄)SD大鼠为研究对象，以人工喂养、缺氧冷刺激为基础条件,选择加或不加LPS(10 mg/kg)灌胃，均诱导出符合NEC临床表现和组织学特征的大鼠模型。

图1 大鼠回盲部肠道病理学观察

表2 大鼠肠道病理积分比较

出生2 h内造模NEC大鼠临床症状重于2日龄NEC大鼠，体质量增长率低于2日龄NEC大鼠，死亡率高于2日龄NEC，大鼠病理学改变重于2日龄NEC大鼠。与临床上孕周越小的早产儿NEC发病率越高、病情越重类似。这可能与早产时肠道Toll样受体4(TLR4)表达量较成熟肠道明显升高[16], 新生大鼠肠组织TLR4表达量随时间逐渐降低[17]，且负调控不足，对肠道细菌表现为过度炎症反应，导致肠道发生严重的炎症反应，肠组织坏死，导致NEC的发生。

LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分，也是穿过肠道黏膜屏障的主要炎症分子之一[6,18]。本实验中同日龄加10 mg/kg LPS灌胃的临床症状和病理学改变(病理积分)重于仅缺氧和冷暴露的大鼠。这可能与LPS能够启动炎症反应，结合CD14/TLR4/MD2受体复合物，促进炎症细胞分泌多种细胞因子，引起强烈的炎症反应，并可激活补体系统和凝血系统等有关。

新生大鼠NEC模型可用于NEC生物标志物研究和发病机制研究，具有价格适宜，可成批量试验等优势，但也要考虑人类和大鼠的差异，对应激的恢复存在差异，当使用大鼠诱导NEC时，大鼠对细菌污染和内毒素具有更好的耐受性。本实验中具备早产、人工喂养、部分母乳接触、缺氧、冷刺激以及LPS灌胃等多种高危因素，与新生儿NEC发病机制的最新研究相似[15]，刚出生的大鼠临床症状及病理情况重于生后2 d大鼠，同日龄大鼠中加LPS灌胃的临床症状和病理学改变重于未加LPS灌胃的大鼠，但都成功诱导出NEC模型，因此可以根据研究内容和目的进行重新组合使用，可靠性和灵活性兼备。