CRTC2/miR-451轴调节非小细胞肺癌患者糖异生途径的机制研究

汪 矗 李 科 石少卿 李 敏

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中约85%是非小细胞肺癌(NSCLC)[1]。NSCLC常诊断在患癌晚期，且患者的5年总生存率非常低[2]。癌细胞的葡萄糖代谢方式主要依靠糖酵解而不是三羧酸循环，由于癌细胞的快速生长会消耗大量的葡萄糖[3-5]，因此机体会通过糖酵解的逆反应-糖异生途径为癌细胞不断地提供葡萄糖。

CRTC2是CREB调节转录的共激活因子，能够促进肝脏的糖异生反应[6-7]。Shi等[8]发现CRTC2能够促进肺癌细胞A549的体外迁移和增殖能力。Li等[9]发现非小细胞肺癌患者的CRTC2及其突变后的蛋白表达水平明显高于正常人群。

本研究发现CRTC2在非小细胞肺癌患者癌组织中的表达水平明显高于癌旁，且与糖异生关键酶G6Pase和PEPCK的表达显著正相关，能够增加NSCLC大鼠的血糖水平、促进糖异生反应并减少细胞凋亡。进一步的机制验证发现miR-451是参与CRTC2促糖异生发生的关键因子，CRTC2通过CREB结合在miR-451的启动子区并抑制miR-451的转录活性，提高miR-451靶基因Gyk及其下游G6Pase和PEPCK的表达水平，从而促进NSCLC的糖异生途径，这为NSCLC的发生提供新的理论依据和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

20只非小细胞肺癌大鼠模型购自广州赛业生物公司；葡萄糖、丙酮酸和胰岛素购自美国sigma公司；CRTC2蛋白、参与糖异生途径的G6Pase 、PEPCK和Gyk蛋白及内参β-actin抗体均购自美国Abcam公司；干扰CRTC2的慢病毒载体、miR-451 mimic、miR-451 inhibitor及pcDNA3.1-CRTC2质粒均购自上海吉玛公司；Tunel凋亡试剂盒、RNA提取及逆转录试剂盒和荧光素酶活性检测试剂盒均购自美国promega公司。染色质免疫共沉淀试剂盒购自美国milippore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 选取本院2015年至2018年收治住院的70例非小细胞肺癌患者，其中男性42例、女性28例；年龄40～70岁，中位年龄57岁；肺鳞癌30例、肺腺癌32例、腺鳞混合癌8例。纳入标准：经病理学和细胞学证实为非小细胞肺癌；肝肾功能、血象正常。

1.2.2 非小细胞肺癌大鼠的处理 将0.2 ml滴度为1×109的阴性对照(sh-Ctr)、干扰CRTC2(sh-CRTC2)慢病毒载体及miR-451抑制剂通过尾静脉注射至非小细胞肺癌大鼠，注射后第五天检测糖异生途径相关指标变化。

1.2.3 葡萄糖代谢检测 葡萄糖代谢检测包括葡萄糖耐量实验(GTT)、丙酮酸耐受实验(PTT)和胰岛素耐受实验(ITT)。对于GTT和PTT实验，大鼠禁食6小时后腹腔注射2 g/kg体重的葡萄糖和丙酮酸；对于ITT实验，大鼠禁食4 h后腹腔注射1单位/kg体重的胰岛素，采用血糖测量仪检测大鼠的血糖浓度。

1.2.4 实时定量PCR检测 采用贴壁细胞RNA提取试剂盒提取非小细胞肺癌细胞株A549的总RNA。将提取的总RNA逆转录成cDNA后，荧光定量PCR检测CRTC2、miR-451、G6Pase、PEPCK和Gyk的表达水平。各检测基因的QPCR引物见表1。QPCR结果采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.2.5 western blot检测 向A549细胞中加入RIpA蛋白裂解液，至4 ℃离心机以12 000 rpm离心10 min，吸取上清加入4倍体积的SDS loading buffer，混匀后放入100 ℃水浴5 min。 取30 μg的蛋白裂解液加入8% SDS-PAGE凝胶中分别以60 V和100 V电压进行蛋白浓缩和分离，然后转至PVDF膜，以10%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入兔抗大鼠CRTC2、G6Pase、PEPCK和Gyk抗体，4 ℃过夜孵育后，ECL发光液显色。

1.2.6 miR-451 mimic及pcDNA3.1-CRTC2转染A549细胞 A549细胞接种至6孔板，当细胞密度达到80%,每孔转染5微升的miR-451 mimic和阴性对照NC，转染24 h后，再转染入1 μg的pcDNA3.1-CRTC2质粒。转染48 h后，检测A549细胞中CRTC2、miR-451、G6Pase、PEPCK和Gyk糖异生途径相关指标的变化。

表1 QPCR检测引物

1.2.7 TUNEL染色检测A549细胞凋亡 A549细胞经miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2质粒转染48 h后，采用4%多聚甲醛固定。再利用TUNEL试剂盒检测A549细胞的凋亡个数，定量结果采用TUNEL阳性细胞核占总细胞核的百分比表示。

1.2.8 荧光素酶报告载体的构建及转染 采用MEME在线预测miR-451启动子上游2000 bp的启动子序列，发现-1121 bp处存在CREB的结合位点。从人基因组中钓取miR-451启动子片段，并构建入pGL3-basic载体中。带酶切位点的引物为Kpn I-miR-451-F：GGTACCTTTAGCTGAAACCGTTGA，Nhe I-miR-451-R：GCTAGCGTAGCGTTGTGATGGATC，构建成功后提取质粒，命名为pGL3-Wt。miR-451启动子上CREB位点的缺失突变由上海生工公司合成，采用DNA合成技术合成不含有CREB结合位点的miR-451启动子，并将此序列克隆至pGL3-basic载体，命名为pGL3-Mut。实验组将pGL3-Wt或pGL3-Mut与pRL-TK载体共转染入A549细胞中，对照组转染pGL3-basic与pRL-TK，每孔转染剂量为2 μg。转染24 h后，裂解细胞并采用promega荧光素酶分析仪检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，两者比值为荧光素酶的相对活性。

1.2.9 染色质免疫共沉淀 取出生长至90%以上的细胞，加入37%多聚甲醛，室温交联10 min后，加入甘氨酸终止交联。将细胞培养基吸出，加入预冷的PBS润洗两次后，将细胞刮下并4 ℃下以2 000 rpm离2 min，收集细胞沉淀加入SDS Lysis Buffer后进行超声破碎。将超声后的细胞分为3组：input组、IgG阴性对照组和加anti-CRTC2抗体组。4 ℃过夜孵育后，于每组加入proteinA磁珠，孵育2 h后洗涤沉淀复合物。将洗涤后的DNA片段用于QPCR分析，设计miR-451启动子-1121位点的QPCR引物，上游：5'-AGCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3'；下游：5'-CCTGCAGTAGGTTTCTGCTGCCTTG-3'。以input为内参，结果采用2-△△Ct法计算相对值。

1.3 统计学方法

采用Graphpadprism 6.05软件统计分析实验数据，单因素方差分析One-Way ANOVA和Student'st检验进行差异比较分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRTC2、miR-451及糖异生途径关键酶在非小细胞肺癌患者中的表达水平

CRTC2、G6Pase和PEPCK在NSCLC患者肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁(P<0.01)，与之相反，miR-451在NSCLC患者肿瘤组织中的表达水平明显低于癌旁(P<0.01)。pearson相关性分析发现70例NSCLC患者的CRTC2与G6Pase和PEPCK的表达水平呈显著正相关(P<0.01)，相关系数分别为0.4815和0.2723；CRTC2与miR-451的表达水平则呈显著负相关(P<0.01，γ=-0.608)。以上结果表明，糖异生途径可能影响NSCLC的发生，CRTC2表达水平与糖异生关键酶G6Pase、PEPCK及miR-451存在明显关联。

2.2 CRTC2通过抑制miR-451表达影响NSCLC大鼠的葡萄糖代谢

设计和构建干扰CRTC2的慢病毒载体sh-CRTC2和miR-451 抑制剂，并通过尾静脉注射NSCLC大鼠和葡萄糖耐量实验(GTT)、丙酮酸耐受实验(PTT)、胰岛素耐受实验(ITT)检测CRTC2和miR-451是否参与NSCLC大鼠的葡萄糖代谢。如图1A-1C所示，检测结果发现三段CRTC2干扰片段中，sh-CRTC2-2的干扰效果最佳，且干扰CRTC2导致miR-451的表达水平显著升高，而糖异生途径关键酶G6Pase和PEPCK的表达明显降低；注射miR-451 inhibitor挽救了被sh-CRTC2抑制的G6Pase和PEPCK表达水平，提示CRTC2上调糖异生途径关键基因G6Pase和PEPCK的表达可能是通过抑制miR-451。与sh-Ctr对照组相比，干扰CRTC2导致NSCLC大鼠饲喂状态和空腹状态下的血糖水平显著下降，而miR-451 inhibitor的注射缓解了血糖的下降程度，见图1D。PTT实验表明sh-CRTC2的NSCLC大鼠新生肝糖原水平低于sh-Ctr组，而miR-451 inhibitor使肝糖原生成水平明显上升；ITT实验显示干扰CRTC2的表达导致血糖水平降低，而注射miR-451 inhibitor缓解了血糖下降趋势，提示NSCLC大鼠对胰岛素的敏感性与CRTC2和miR-451的表达有关，两者分别发挥着促进和抑制的作用；GTT实验表明干扰CRTC2导致外源葡萄糖的消耗更加迅速，明显快于sh-Ctr组大鼠，因此导致血糖水平降低的更快，注射miR-451 inhibitor挽救了血糖水平的降低趋势，使其回升的血糖水平明显高于sh-CRTC2组，见图1E-1G。

注：图1A-1B表示CRTC2三段干扰序列在NSCLC肺癌组织中的干扰效果；图1C表示CRTC2和miR-451 inhibitor对G6Pase和PEPCK RNA水平的影响；图1D表示空腹和喂食状态的NSCLC大鼠的血糖水平受到CRTC2干扰和miR-451 inhibitor的影响；图1E-1G分别表示CRTC2干扰和miR-451 inhibitor影响PTT、ITT和GTT实验下的NSCLC大鼠血糖水平。

2.3 CRTC2/miR-451轴通过促进糖异生途径抑制细胞凋亡

本研究采用Tunel凋亡实验检测NSCLC细胞A549在经受miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2转染后的凋亡情况，结果发现相比NC对照转染组，转染miR-451 mimic促进A549细胞的凋亡，而Gyk、PERCK和G6Pase的表达受到抑制；在转染miR-451 mimic的基础上再次转染pcDNA3.1-CRTC2，结果发现与单独转染miR-451 mimic相比，A549的细胞凋亡个数减少，且受miR-451抑制的Gyk、PERCK和G6Pase表达水平明显回升，见图2A-2D，以上结果证明miR-451能够抑制糖异生途径并促进细胞凋亡，而CRTC2减弱了miR-451对糖异生的抑制作用，及其引起的A549细胞凋亡。

A和B表示A549细胞凋亡实验的检测结果；C和D表示western blot和QPCR检测miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2转染的A549细胞中miR-451靶基因Gyk及下游PERCK和G6Pase的表达水平。

2.4 CRTC2抑制miR-451的分子机制

我们采用hTTP://meme-suite.org/数据库在线预测miR-451上游2 000 bp启动子序列，发现-1121 bp处存在CREB的结合序列。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验发现，干扰CRTC2导致CREB与miR-451启动子-1121 bp处的结合能力明显下降，见图3。将大小为2000 bp的miR-451启动子克隆至pGL3-basic载体，重组载体命名为pGL3-Wt，CREB位点缺失突变的miR-451启动子重组载体命名为pGL3-Mut。荧光素酶报告系统结果显示pGL3-Mut的双荧光素酶活性明显高于pGL3-Wt，而干扰CRTC2导致pGL3-Wt和pGL3-Mut的双荧光素酶活性明显高于sh-Ctr对照组，表明miR-451启动子-1121 bp处的CREB结合序列是CRTC2抑制miR-451转录活性的关键位点，突变此位点序列或干扰CRTC2都能够增强miR-451启动子的转录活性。

3 讨论

肿瘤细胞的代谢重编程，被认为是癌症发生的标志之一，在过去的十年中，与肿瘤发生、发展和转移相关的代谢途径逐渐被报道，如戊糖磷酸途径、丝氨酸甘氨酸途径和糖酵解途径[10-12]，但与糖酵解相逆的糖异生途径却鲜有报道。糖异生途径是机体中的非碳水化合物碳源如乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油等物质转变为糖(葡萄糖或糖原)的过程，在空腹或饥饿状态下，机体主要依靠糖异生途径维持正常血糖浓度。这致使糖酵解或糖异生反应会不可避免地造成细胞的代谢压力，进而导致癌细胞的代谢重编程受损[13-16]。因此，糖酵解或糖异生途径作为代谢重编程的治疗靶点对癌细胞的生长和生存至关重要。

A表示ChIP实验验证-1121位置的结合位点与CRTC2和CREB转录复合物的结合能力；B表示荧光素酶实验验证干扰CRTC2对miR-451野生型及突变型的启动子活性的影响。

CRTC2作为人体血糖调节的开关性蛋白，在正常情况下，以磷酸化形式存在于细胞质中，当接收活化信号，CRTC2迅速去磷酸化并转位至细胞核中与CREB蛋白形成转录复合物，激活糖异生关键酶G6Pase、PEPCK的表达，从而调节糖异生途径。CRTC2与癌症发生的相关报道较少，Fang等[17]的研究发现CRTC2是淋巴瘤抑制因子，能通过转录DNA得错配修复来保持基因组的完整性；Brown等[18]发现CRTC2通过调节芳香化酶，影响更年期和肥胖相关得荷尔蒙环境，并在肥胖和乳腺癌之间建立联系。此外，Li等发现CRTC2及其突变体在非小细胞肺癌组织中的表达水平高于癌旁组织。以上报道提示CRTC2作为调节糖异生途径的关键因子亦可能参与癌症的发生。本研究通过对70例非小细胞肺癌患者癌和癌旁组织的定量分析，发现CRTC2在NSCLC癌组织中的表达明显高于高旁，这与Li的报道一致。不仅如此，CRTC2与糖异生关键酶G6Pase和PEPCK的在肿瘤组织中的表达均高于癌旁，且与CRTC2呈显著正相关，表明CRTC2在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达水平可能影响糖异生途径。

肿瘤细胞中的miR-451处于失调状态，能通过靶向抑制多个分子发挥促癌或抑癌的作用。研究发现miR-451在非小细胞肺癌组织中的表达降低，而上调miR-451能够增强非小细胞肺癌对放疗和顺铂化疗的敏感性[19-20]，表明miR-451对NSCLC的发展发挥着抑制作用。而在高脂饮食诱导的糖尿病小鼠和肥胖小鼠肝脏中，miR-451表达上升，表明其参与肝脏的代谢紊乱[21-22]。Shu等[23]发现miR-451是糖异生反应的上游抑制因子，能够靶向抑制Gyk的表达从而进一步阻遏AKT-FOXO1-PEPCK/G6Pase 通路。本研究发现miR-451在NSCLC癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且与CRTC2的表达呈显著负相关，推测miR-451可能与CRTC2共同参与NSCLC的发生。为证实此猜想，进一步的研究利用干扰CRTC2的慢病毒载体和miR-451抑制剂通过尾静脉注射至NSCLC大鼠模型中，通过QPCR和葡萄糖耐量实验(GTT)、丙酮酸耐受实验(PTT)和胰岛素耐受实验(ITT)证实缺乏CRTC2导致miR-451表达上升，且降低空腹和饱腹状态下NSCLC大鼠的血糖水平，而miR-451 inhibitor在降低miR-451表达的同时，亦挽回了CRTC2缺陷大鼠的血糖下降趋势，使其血糖水平高于仅注射sh-CRTC2的NSCLC大鼠，表明CRTC2/miR-451轴具有稳定NSCLC大鼠血糖水平的功能。

已有的研究证实敲除肺癌细胞中的PERCK能够增强葡萄糖耗竭诱导的细胞凋亡，miR-451能够靶向调节Gyk控制PERCK的表达[23]，提示miR-451不仅能够抑制糖异生途径，还能通过下调PERCK引起细胞凋亡。为证实CRTC2通过糖异生途径影响非小细胞肺癌发生的进程，本研究通过向A549细胞转染miR-451 mimic、过表达CRTC2(pcDNA3.1-CRTC2)的载体以及细胞凋亡实验，发现miR-mimic导致A549凋亡细胞增加，而lv-CRTC2则抑制了miR-mimic的促凋亡作用。进一步，通过western blot和QPCR发现CRTC2阻遏了miR-451对Gyk的靶向抑制，表现为Gyk及其下游的G6Pase和PEPCK表达升高，由于PEKCK参与葡萄糖消耗引起的细胞凋亡，因此本研究结果表明CRTC2通过抑制miR-451的表达促进糖异生途径，并参与NSCLC细胞的凋亡抑制。

CRTC2作为CREB的共激活因子共同参与调节细胞的内质网应激和糖异生途径[24]。本研究采用在线分析hTTP://meme-suite.org/预测miR-451上游启动子的-1121bp处存在CREB的结合序列。进一步，将miR-451启动子及其CREB位点突变序列克隆至荧光素酶报告载体，并采用ChIP检测CRTC2与CREB的转录复合物与-1121bp位点的结合能力和miR-451启动子的转录活性，结果发现干扰CRTC2明显阻遏了其与miR-451启动子的结合能力，并导致启动子的转录活性升高，表明-1121bp位点对miR-451启动子的抑制作用；进一步的点突变实验结果发现野生型的miR-451启动子活性明显低于突变型，而在CRTC2干扰的A549细胞中，突变型启动子的活性升高的更为明显，表明-1121bp处的CREB结合序列是抑制miR-451启动子活性的关键位点，CRTC2通过此位点抑制miR-451的转录，下调其在NSCLC细胞中的表达。

综上所述，CRTC2是参与非小细胞肺癌糖异生反应的上游关键因子，通过转录抑制miR-451，增强miR-451下游Gyk、G6Pase和PEPCK的表达，并进一步减少NSCLC细胞的凋亡，这为NSCLC的发生提供新的理论依据和作用机制。