特异性表达Her-2抗原树突状细胞疫苗治疗非小细胞性肺癌体外抗瘤效应的研究

钭方芳 简 艳 郭善娴 蔡 云 陈小丹 郭昌莹

肺癌是中国乃至全世界肿瘤发病率和死亡率最高的癌种[1]，手术和放化疗是其传统的治疗模式，但5年生存率不足15%[2]。靶向治疗的出现使肺癌的5年生存率提高至17%以上[3]。多数患者就诊时即为中晚期。放化疗及靶向治疗不仅能杀伤癌细胞，对机体正常细胞和免疫系统也有一定的损害。近年来，随着分子生物技术的发展和基因工程技术的进步，免疫治疗取得重大突破，尤其是免疫检查点抑制剂(PD-1)的上市，显著提高晚期肺癌的生存期[4]，提取患者外周血培养DC疫苗和细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induce killer,CIK)免疫治疗出现的副反应轻微，疗效可，是值得深入探索的重要治疗方案，尤其是晚期体质欠佳肺癌患者的解救措施[5]。

本研究从细胞和分子水平研究癌基因的肿瘤抗原性，在目前成熟技术的DC疫苗免疫治疗基础上，将Her-2基因通过慢病毒载体方式转染重组DC基因组，使其持续在DCs中表达，探索其对淋巴细胞的激活功能及对Her-2阳性肺癌细胞株的免疫抗肿瘤效果，改善DC疫苗抗肿瘤治疗的瓶颈问题，为进一步探索新的高效的肿瘤治疗方式奠定充分的理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和癌株

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro、pMD2.G、pMDL-G/P-RRE、pRSV-REV(Biocat公司)；pcDNA3.1-ERBB2-EGFP(香港中文大学生物医学院赠)；人胚肾细胞株293FT、大肠杆菌Top 10(香港中文大学生物医学院赠)，细胞株(A549肺腺癌、H460大细胞肺癌、H1299肺腺癌、H441肺腺癌，H2170肺鳞癌，HCC827非小细胞肺癌，均由本实验室保存)。

1.2 试剂

限制性内切酶NotI、XbaI、T4 DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；DNA凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司)；DNA marker、PCR试剂盒、质粒快速提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(天根公司)；IL-2(双鹭公司)；IFN-γ(华新公司)；CD3(Biolegend)；GM-CSF、IL-4、TNF-α(Peprotech)； CerBb-2兔单克隆抗体(福州迈新)；CD83 APC、CD86 FITC、HLA-DR PERCP、CD1α PE、CD3 FITC、CD56 PE(BD Biosciences)；CCK8试剂盒(南京建成)。

1.3 ERBB2慢病毒载体构建及其表达

根据Her-2基因片段设计引物，上游引物1：5'GAAGATTCTAGAATGGAGCTGGCGGCCTTG3'，在5'端引入Xba I酶切位点和保护碱基；下游引物2：5'GAAGGAGCGGCCGCCCTCACACTGGCACGTCCAGA3'，在5'端引入Not I酶切位点和保护碱基；ERBB2长度：3768 bp。PCR条件设置为：94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min 30 s，循环32个周期，扩增ERBB-2基因片段，琼脂凝胶回收试剂盒提取PCR产物，将扩增的Her-2基因片段与慢病毒质粒连接室温下孵育2.5 h构建慢病毒载体(LV-Her2载体)，热休克法转化Top 10感受态菌，收集单克隆菌落后,复苏Lenti-X-293T细胞，按接种密度5×105个/ml置于15 cm的培养皿中，培养液为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。当细胞覆盖培养皿面积为90%时，以1∶9的比率进行传代。取2× HBS13.5 ml，0.25MCaCl2溶解液13.5 ml，TE buffer 12.2 ml，包装质粒pMD 2.0 95 μg，pMDL-G/P-RRE 176 μg，pRSV-REV 68 μg，病毒质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-Her2 270 μg，涡旋混匀。加入均匀铺满约40%的293T中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养16 h。16 h后更换新的培养液22.5 ml。再次孵育30 h后，收集含病毒的上清液，800 rpm，离心10 min。用0.45 μm的过滤网过滤。同时每400 μl的慢病毒上清液加入100 μl的PEG-itTM配制，1 500 rpm，离心30 min，上清液多次离心收集慢病毒载体。检测病毒滴度。

1.4 疫苗制备

用含有肝素的抗凝管收集人外周血30 ml， 加入含Ficoll的离心管，反复离心后取单个核细胞的白膜层进行培养，以1.5×106个/ml的接种密度分装入3个T25培养瓶中，每瓶共有培养基约6 ml，记为A、B、C。置于37 ℃、5%CO2培养箱2 h，向三个培养瓶中分别加入 IL-4，GM-CSF和30 μl血浆作DC培养。第5天分别向B和C加入空载体LV和LV-Her2转染DC，取MOI=10，病毒剂量=MOI×细胞数/滴度(TU/ml)×1000。第6天加入TNF-α 12 μl，第8天观察绿色荧光蛋白表达情况，细胞刷刮出细胞，1 200 rpm，离心5 min，计数：0.6×106个/ml，流式细胞学测三组培养瓶中细胞的CD83/86/1α和HLA-DR的表达情况，评估DC疫苗的成功率。

CIK疫苗制备：计数新培养瓶A1，B1，C1细胞数为：0.9×106个/ml，同时加入IFN-γ，CD3pure、血浆进行CIK培养。分别隔天计数CIK数量，补液至密度1.5×106个/ml。在CIK培养的第8天加入DC对照组疫苗、LV-DC空载体组疫苗、LV-Her2-DC实验组疫苗(计数CIK∶DC为10∶1)，进行DC-CIK疫苗培养，第14天收集CIK，取少量CIK调整密度为105个/ml，流式细胞仪测三组细胞表面CD3/56表达情况，评估CIK疫苗的成功率。

1.5 淋巴细胞增殖反应

将三组DC疫苗诱导的CIK分别接种于96孔板中，每孔105个细胞，培养液为100 μl/孔，设置6复孔，放于细胞培养箱中48 h。每孔加入10%总体积的CCK8试剂，置于培养箱内4 h，450 nm波长下测量OD值。评估三组DC疫苗诱导淋巴细胞增殖能力。

1.6 免疫组化筛选表达Her-2的肺癌细胞株

将已消毒好的玻片放置在10 cm的培养皿中，培养实验室保存的A549肺腺癌、H460大细胞肺癌、H1299肺腺癌、H441肺腺癌，H2170肺鳞癌，HCC827非小细胞肺癌细胞株，按接种密度为2×105个/ml进行细胞爬片，细胞培养箱内培养48 h。免疫组化法评估各个细胞株Her-2表达能力。筛选Her-2表达能力最强的细胞株进行杀伤实验。

1.7 DC-CIK杀伤肺癌细胞的效率

将筛选出表达Her-2的A549肺癌细胞接种在96孔板中，每孔数量为：5×103个，培养液体积为：100 μl，培养箱内培养24 h。按效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1的比率加入三组DC疫苗诱导的CIK中进行体外杀伤，每组设置3复孔。效靶细胞共培养48 h后，加入10 μl CCK8试剂，继续培养4 h，450 nm下酶标仪测量每孔的OD值。杀伤率计算公式如下：杀伤率=[1-(效靶实验孔OD-效应细胞孔OD)/靶细胞孔OD]×100%。

1.8 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件分析数据，t检验对比实验组与对照组之间的差异，随机区组方差分析比较多组变量之间的差异，定义P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 Her-2基因克隆PCR结果

利用PCR成功扩增出pcDNA3.1-ERBB2-EGFP质粒中需要的ERBB2基因片段(图1)

M为DNAladder；PCR为加入引物扩增后的产物；Con为原始质粒。

2.2 感受态菌落中重组质粒Her-2基因鉴定

电泳可见感受态菌落中有含Her2基因的质粒(见图2)。

M为DNAladder；PCR为加入引物扩增后的产物；Con为原始质粒。

2.3 病毒滴度测定

随着稀释程度的增加，可见荧光显像细胞数递减(图3)。

图3 荧光显微镜下慢病毒感染293T细胞图像

2.4 DC疫苗、DC-CIK细胞培养

单个核细胞在细胞因子GM-CSF和IL-4诱导下贴壁生长，边界逐渐不整齐并有小的突起，加入TNF-α后突起明显，外形如树突状形态；在IFN-γ、CD3和IL-2诱导下分化为悬浮生长的CIK，细胞逐渐增大，可见集落，胞膜光滑无突起，胞质内有分泌颗粒。

2.5 慢病毒转染DC疫苗情况

取MOI=10，空载体病毒和LV-Her2转染DC效率分别为40.2%和41.8%，无统计学差异(P=0.293)。

2.6 三组DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR的流式检测结果(表1)

表1 三组DC疫苗表面分子表达情况

2.7 三组DC疫苗诱导制备CIK后表面分子CD3/56的流式检测结果(表2)

表2 三组DC-CIK疫苗表面分子CD3/56的表达情况

2.8 各组DC疫苗刺激CIK增殖结果(表3)

CCK8法检测CIK增殖情况，发现LV-Her2-DC实验组诱导CIK增殖明显增强，明显高于LV-DC空载体组和单纯DC对照组，方差分析发现三组CIK增殖情况并不完全相同(P=0.00)。LV-DC组与单纯DC组CIK增殖无明显差异(P=0.06)，LV-Her2-DC实验组明显高于单纯DC对照组，有统计学意义(P=0.01)。

表3 三组CIK增殖能力比较

2.9 肺癌细胞株免疫组化结果

显微镜下观察发现：A549肺癌细胞胞膜染色呈弱而不完整的着色，根据Her-2诊断标准，Her-2免疫组化结果为+。余细胞株未见明显着色。

2.10 CCK8检测CIK对肿瘤细胞的杀伤率结果

分别将三组DC-CIK加入A549肺癌细胞培养瓶中共培养，镜下发现DC-CIK体型小且呈圆形，A549贴壁生长，外观大呈不规则形态，共培养48 h后发现DC-CIK浸润在A549肿瘤细胞周围，A549肺癌细胞破裂死亡，且效靶比越高，A549肺癌细胞死亡越明显。三组DC-CIK在不同效靶比下杀伤率有差异(P=0.003)，其中空载体组与DC-CIK疫苗杀伤效果无统计学差异(P=0.654)，见表4。

表4 三组CIK对A549的杀伤率/%

注：P为不同效靶比下LV-Her2-DC-CIK实验组与单纯DC-CIK对照组对A549肿瘤细胞杀伤能力差异的统计学分析。

3 讨论

肺癌细胞表达多种特异性癌抗原，是具有免疫原性的恶性肿瘤[6]。其中，DCs作为机体最强大的抗原专职递呈细胞，能够高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类主要组织相容性复合物，具有免疫刺激能力，能高效激活初始型T细胞，在机体免疫应答反应中起关键作用。体外培养DC疫苗回输体内可弥补肿瘤微环境中免疫系统的抑制，诱发且增强细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤，目前已广泛应用于临床。除外传统的单纯DC疫苗，还有抗原肽或全肿瘤抗原致敏的DC疫苗，将特异性肿瘤抗原或全肿瘤抗原负载在DCs表面，诱导机体针对某一特定抗原或含有某一抗原物质的细胞进行杀伤[7]。

近年来，多数研究发现肿瘤相关性抗原可作为内源性抗原分子被机体抗原递呈细胞识别，以Ⅰ类MHC-多肽的形式递呈至淋巴细胞诱发细胞毒性T淋巴反应(cytotoxic lymphocyte，CTL)或在胞内加工处理后以Ⅱ类MHC-多肽的形式递呈诱导产生免疫应答。目前已证实的癌基因如K-ras[5]、p53[8-9]、MAGE-A3[10]、CK19[11]等表达蛋白均可诱发机体免疫应答，是潜在的靶向抗原基因。有文献报道Her-2蛋白在胃癌、乳腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中均有较高表达[12]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中Her-2蛋白表达率高达20%～30%[13]，Her-2突变率高达4%左右[14]。曲妥珠单抗可明显改善乳腺癌和胃癌Her-2高表达患者的生存期，然而对肺癌Her-2阳性患者疗效并不佳[15]。从免疫学角度设想，如果增强抗原递呈细胞对Her-2的捕获能力，提高CD8+等效应T细胞对Her-2阳性肿瘤的识别和杀伤效果，提高机体对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而起到杀伤肿瘤细胞以及清除潜伏转移病灶的作用。因此，我们以Her-2基因为靶标，通过慢病毒载体导入DC抗原递呈细胞来增强Her-2的表达量，增强靶抗原的提呈能力，提高机体免疫系统识别能力，从而建立起一条新的针对肺癌驱动基因表达的治疗途径来评估其杀瘤效应。

有学者利用慢病毒载体将MAGE-A3基因重组于DCs中，制作能持续表达MAGE-A3蛋白的DC疫苗，发现其能高效的诱发抗肿瘤免疫应答反应并能杀死表达MAGE-A3癌细胞，进一步支持本研究的可行性[10]。我们通过慢病毒载体将Her-2全基因组整合入慢病毒质粒中，获取携带Her-2基因的慢病毒载体，并转染DCs制备表达该抗原的DC疫苗。本研究证实，空载体转染DC与单纯DC比较，流式细胞学显示DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表达无明显差异(P>0.05)。本研究发现空载体病毒和Her-2慢病毒载体DC转染效率分别可达到40.2%和41.8%，两组载体转染效率无明显差异(P=0.29)，未见DCs漂浮死亡等现象发生，提示当MOI为10时，慢病毒转染后DC生长不受影响且携带Her-2基因的慢病毒颗粒不降低感染能力，证实Her-2慢病毒载体可有效的感染DCs。同时发现利用基因转染技术将特异性基因片段重组于DC疫苗基因组可内源性高效持久的表达肿瘤抗原表位，激活CTL免疫应答，且能有效的克服HLA限制，可批量性生产[10]。结合Her-2基因潜在的肿瘤抗原性，我们利用基因工程技术将其整合至DC基因组，制备可持续表达Her-2的DC疫苗，使之能持久高效的表达肿瘤抗原，同时还刺激DC疫苗本身和体内其它DCs的成熟，增强了肿瘤抗原递呈能力，激活机体建立抗肿瘤免疫应答能力，并重建T细胞免疫功能，为肺癌等多种Her-2阳性的肿瘤患者探索一条新的治疗途径。

临床上用于被动免疫治疗的淋巴细胞主要有：LAK细胞、CIK疫苗、NK细胞和CD3AK细胞等。其中，CIK可同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，兼具NK细胞非MHC限制性杀瘤和T淋巴细胞的高效抗性特点，同时CIK增殖速度快、抗凋亡和杀瘤能力不受细胞耐药性影响。有学者发现DCs刺激CIK后的过继免疫疗法明显比单纯的DC疫苗主动免疫治疗或单纯的CIK过继免疫治疗对肿瘤的杀伤率要高[16]，故本研究选用CIK作为肿瘤杀伤T淋巴细胞。DCs诱导CIK增殖反应结果显示：Her-2基因修饰的DCs激发CIK增殖活化能力明显高于单纯DCs和空载体DCs(P=0.003)，提示LV-Her2-DC疫苗在体外能有效的诱导淋巴细胞活化增殖。而空载体DCs和单纯DCs激发CIK增殖活化相比较并未表现有统计学差异(P=0.654)，进一步证实慢病毒载体不损害DC功能。流式细胞学检测CIK表型发现均表达CD3/CD56，与多数研究中得到的慢病毒转染后DCs并不改变DCs及CIK本身功能结果相似，包括不影响DCs和CIK的成熟分化[17-18]。

Her-2蛋白在肿瘤的发生发展中占据重要角色，主要参与肺癌、乳腺癌和胃癌等多种肿瘤的MARK和PI3K信号传导途径，因此，本研究以Her-2为靶基因，建立一条新的细胞免疫抗肿瘤途径。在实验中Her-2表现出强烈的自体异源性，刺激CIK活化增殖，约为单纯DC刺激CIK诱导细胞活化及数量增殖能力的2倍，为杀伤肿瘤细胞打下坚实的基础。继曲妥珠单抗有效应用于乳腺癌和胃癌的治疗以来，一系列以Her-2为靶点的肿瘤治疗策略相继被建立，包括靶向Her-2抗原肽负载DC的主动免疫治疗，我们构建的Her-2慢病毒载体在转染DCs后，可将Her-2片段重组于DCs基因组内，表达的Her-2蛋白被内源性递呈诱发CTL反应，同时Her-2的整个cDNA可能含有其它未知的抗原决定簇，同时递呈识别发挥最大限度的DCs免疫抗原递呈功能；再次，DCs表面持续表达的Her-2抗原能持续的刺激DCs，克服MHC-抗原肽复合物降解对其产生的损伤。

本研究以弱表达Her-2蛋白的A549肺癌细胞作为靶细胞进行体外杀伤实验验证，结果表明效靶比越高，肿瘤杀伤率越高，Her-2慢病毒转染组杀伤率明显高于空载体转染组和单纯DC组(P<0.05)，而空载体组与对照组杀伤率并未发现有统计学区别(P=0.654)，再次证实Her-2修饰的DC疫苗的有效性和高效性。

综上所述，构建特异性表达Her-2的慢病毒载体感染DCs后，可通过有效的递呈肿瘤抗原来高效激活淋巴细胞，促进免疫应答，在体外试验中表现出较强的杀瘤效果。这一结果为建立针对非小细胞性肺癌的特异性靶向免疫治疗方案提供了一定的实验依据。同时，基于免疫细胞在体内和体外环境中存在的功能差异和干扰因素问题，LV-Her2转染DCs作为疫苗治疗非小细胞性肺癌还有待于通过严格设计的临床实验来进行验证。期望以后能通过进一步优化实验设计条件，获取更加完善的研究结果，为建立更有效治疗肺癌的临床方法提供更加有效、合理的依据。