微小核糖核酸106b对肝细胞葡萄糖异生的影响及机制*

付学东， 王寿懿， 朱志强， 邓幼平

((武汉大学中南医院儿科， 湖北武汉 430071)

糖尿病严重威胁人类身体健康。2017年，全球共有4.25亿成人糖尿病患者。其中，中国成人糖尿病患者人数高达1.14亿, 位居世界第一, 占总数的1/4以上。糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病。2型糖尿病的基本特征是葡萄糖体内平衡失调，导致高血糖。其中，细胞葡萄糖摄取和内源性葡萄糖产生之间的协调调节对维持正常的血糖浓度具有至关重要的作用，肝细胞在此过程中具有重要影响。肝细胞通过控制葡萄糖生成(葡萄糖异生)和糖原分解的过程，改变肝葡萄糖的释放，从而影响血糖水平[1-2]。因此，探讨肝葡萄糖异生的分子机制对2型糖尿病的靶向治疗具有特殊意义。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA，miR)与2型糖尿病的发生、发展、防治密切相关，包括对肝细胞葡萄糖异生的影响。研究表明miR-9，miR-21，miR-214，miR-451等参与对胰岛素抵抗和肝细胞葡萄糖异生的调节，从而导致血糖水平升高，促进糖尿病的发生、发展[3-6]。miR-106b被认为是一个原癌基因(oncogene)，参与肿瘤的发生、进展、与恶化[7-8]。此外，miR-106b还具有其他功能，如通过对NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，核因子活化B细胞κ轻链增强子)信号通路的调节，miR-106b的过度表达可减轻心脏内皮细胞的炎症损伤[9]。由于在胰岛素抵抗的骨骼肌组织中高表达，miR-106b也被认为与骨骼肌的胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生相关[10-11]。研究表明，miR-106b除调节胰岛素抵抗、脂肪细胞分化等与糖尿病发生、发展密切相关的因素外，还可以直接影响血糖水平[10-11]。尽管肝葡萄糖异生在血糖升高和糖尿病的发生、发展中具有重要意义，但miR-106b对肝葡萄糖异生的影响未见报道。本研究的目的旨在观察miR-106b对肝细胞葡萄糖异生的影响，并探讨其可能的机制，为糖尿病的发生、发展提供新的实验依据，并为降糖治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、主要仪器

DMEM液体培养基、FBS、penicillin/streptomycin等购自Gibco公司；抗STAT3(signal transducer and activator of transcription 3，信号传导与转录激活因子3)和磷酸化STAT3抗体购自Cell Signaling Technology公司；抗PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)和G6Pase(glucose-6-phosphatase，葡萄糖-6-磷酸酶)抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；抗tubulin抗体和所有II 抗均购自Sigma-Aldrich公司；STAT3抑制剂NSC74859 来源于Selleck公司；成熟miR-106b序列为：5’-CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC-3’，其模拟物(mimic)和抑制物(antagomiR)、以及相应的对照物(negative control)均来源于Ambion公司(货号：MC12321，4464058，AM17010)；Lipofectamine 2000 RNAiMAX转染试剂、及其DMEM购自Invitrogen公司。

本研究中使用的关键仪器包括：IX51倒置显微镜来自日本Olympus株式会社，MCO-15AC二氧化碳培养箱来自日本SANYO公司，Applied Biosystems实时荧光定量PCR(qPCR) 平台(7500 Fast & 7500 Real-Time PCR System)来自美国ThermoFisher公司)，蛋白免疫印迹使用的电泳仪 、制胶板、 电泳槽、成像系统等均来源于美国Bio-Red公司。

1.2 细胞培养

人正常肝L02细胞系来源于上海中国科学院典型培养物保藏中心(Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences，Shanghai)，在含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、2 mmol/L 谷氨酰胺(glutamine)、100 U/ml青霉素(penicillin)和100 mg/ml链霉素(streptomycin)的DMEM培养液、37℃、5% CO2条件下培养。

1.3 L02细胞转染miR-106b模拟物或抑制剂

L02细胞正常培养在含10% FBS的DMEM中。在本研究中，第5代L02细胞按2×105cells/ml细胞数量的浓度接种至6孔板中，培养18 h后的第6代L02细胞用于细胞转染。转染方法如下：70%～80%融合的L02细胞培养于DMEM中，利用Lipofectamine 2000 RNAiMAX转染试剂转染miR-106b模拟物、抑制剂、或各自的对照物，使用浓度均为20 nmol/L, 操作严格按试剂说明书进行。

1.4 培养液中葡萄糖含量的检查

为检查培养液中的葡萄糖含量，L02细胞培养于无糖无酚红DMEM中，并加入葡萄糖异生底物(10 nmol/L 乳酸、1 mmol/L丙酮酸)、100 nmol/L 地塞米松、100 μmol/L cAMP。在20 μmol/L的miR-106b模拟物或抑制剂处理24 h后，利用葡萄糖检查试剂盒(Glucose Assay Kit(ab65333)，Abcam公司)检测培养液中葡萄糖浓度，操作严格按试剂盒说明进行。

1.5 定量RT-PCR

利用带SYBR-绿色荧光(SYBR-green fluorophore)的7500 Real Time System进行定量RT-PCR。 PCR基本过程如下，40 ng的cDNA作为模板， 95℃10 min，循环参数为95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 30 s、60℃ 15 s，共40个周期。使用仪器自带系统软件(7500 Software v2.05)分析荧光强度，β-actin作为内参，利用2-ΔΔCt法获得相对值。本研究中使用的GCK (glucokinase，葡萄糖激酶)上游引物序列为5’-GCCTTGACTCTGGTAGAGCAG-3’，下游引物序列为5’-ATCACCCTGAAGTTAGTGCCA-3’；PCK1 (phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1)的上游引物序列为5’-GAAATCTTAGCATGCCTCCA-3’，下游引物序列为5’-AAATATCACACAGACACATGTGC-3’；STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription 3)；上游引物序列为5’-CTTTGAGACCGAGGTGTATCACC-3’,下游引物序列为5’-GGTCAGCATGTTGTACCACAGG-3’；beta-Actin的上游引物序列为5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游引物序列为5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-’3。

1.6 蛋白免疫印迹(Western blot)

实验按常规方法进行，简述如下：细胞裂解液裂解细胞，Bradford试剂检测蛋白含量，并调整蛋白浓度为2 μg/μl；细胞裂解液与等量的2SDS 上样缓冲液混合，100 °C加热10 min，14 000 r/min、4°C离心10 min，取上清用于上样；SDS-PAGE 胶分离蛋白、电转移蛋白到硝化纤维素膜上；5% 脱脂牛奶室温封闭1 h、 I 抗4°C过夜、II 抗室温1 h；蛋白表达通过ECL显示；蛋白表达的相对密度利用Quantity One软件(Bio-Rad实验室公司)分析。所有实验至少重复4次，并具有相似的结果。以内参蛋白(如tubulin或总蛋白)为参照，计算实验组蛋白以及磷酸化蛋白表达的相对变化值。组间比较时，设定对照组值为1，计算实验组蛋白或磷酸化蛋白的相对变化。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 miR-106b对肝细胞葡萄糖异生的影响

Western blot和RT-qPCR检测肝细胞葡萄糖异生相关基因的mRNA和蛋白表达，结果发现转染miR-106b模拟物(mimic)的人L02肝细胞显著增加了PEPCK和G6Pase的蛋白表达 (1±0vs2.90± 0.31，P<0.01；1±0vs1.68±0.30，P<0.01)、以及PCK1的mRNA表达(1±0vs4.22±0.36，P<0.01)，降低了GCK的mRNA的表达(1±0vs0.28±0.07，P<0.01，图1)。

与转染miR-106b模拟物(mimic)的人L02肝细胞相反，转染miR-106b抑制剂(antagomiR-106b)的人L02肝细胞显著降低PEPCK蛋白(1±0vs0.23±0.09，P<0.01)、G6Pase蛋白(1±0vs0.34±0.08，P<0.01)和PCK1 mRNA(1±0vs0.38±0.11，P<0.01)的表达，增加GCK mRNA(1±0vs3.29±0.29，P< 0.01)的表达(图2)。

通过检查培养基中葡萄糖浓度，结果发现20 nmol/L的miR-106b模拟物作用24 h显著增加培养基中葡萄糖浓度(43.25±2.36vs124.37 ±9.63 μmol/L,P<0.01)，而同样时间和剂量miR-106b抑制剂处理的细胞，其培养基中葡萄糖含量与对照组比较明显降低(42.87±3.21vs30.34 ±2.75 μmol/L,P<0.01)。

Fig. 1 The effects of miR-106b mimic transfection on hepatic n=4)

Fig. 2 The effects of antagomiR-106b transfection on hepatic n=4)

2.2 MiR-106b对肝细胞STAT3蛋白表达的影响

为观察miR-106b对参与调节肝细胞葡萄糖异生的信号系统的影响，L02细胞分别转染miR-106b模拟物(mimic)或抑制剂(antagomiR)，Western blot检测部分信号分子的蛋白表达, RT-PCR检测STAT3 mRNA的表达。结果发现与正常对照组比较，转染miR-106b模拟物(mimic)显著抑制STAT3蛋白的表达(1±0vs0.45±0.10，P<0.01)；而转染miR-106b抑制剂(antagomiR)显著提高STAT3蛋白的表达(1±0vs1.76±0.28，P<0.01)，但并不影响STAT3 mRNA的表达(分别1±0vs1.06±0.15，P> 0.05; 1±0vs1.05±0.24，P>0.05)。研究同时发现，miR-106b的表达水平对PI3K信号通路的关键信号蛋白如PDK1、Akt的蛋白表达无影响(图3)。

2.3 STAT3对肝细胞葡萄糖异生的影响

为证实STAT3在miR-106b影响肝细胞葡萄糖异生中的介导作用，转染miR-106b抑制剂(antagomiR-106b)的L02细胞接受100 μmol/L的STAT3特异性抑制剂NSC74859处理18 h。结果发现，与单纯转染antagomiR-106b抑制剂(antagomiR-106b)的L02细胞比较，NSC74859处理可显著降低STAT3的磷酸化、提高PEPCK和G6Pase的蛋白表达、增加PCK1的 mRNA表达、降低GCK的mRNA表达(图4，表1)。

Fig. 3 The effects of miR-106b on the protein and mRNA abundances of STAT3 in the L02 n=4)

3 讨论

肝葡萄糖异生是肝脏葡萄糖代谢的主要组成部分，受一系列的转录因子调控，其中葡萄糖异生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)起到重要作用。G6Pase和PEPCK是决定葡萄糖异生的关键环节，因而其蛋白、基因、或活性的变化通常用来反应肝葡萄糖异生活动的增强或降低。而糖激酶(GCK)是调节人体血液中葡萄糖水平的重要酶，主要作用是监控血中的葡萄糖水平。临床上，由于葡萄糖激酶过度激活或者失活，导致血液中葡萄糖水平过低或过高，继而引发2型糖尿病和高血糖症病变。本研究利用L02肝细胞模型，通过观察G6Pase和PEPCK的蛋白表达，以及PCK1和GCK mRNA的表达，结合培养液中的葡萄糖含量，确定miR-106对肝细胞葡萄糖异生的影响。

本研究的结果表明，转染miR-106模拟物(mimic)可增加肝细胞葡萄糖异生限速酶G6Pase和PEPCK(图1)、提高培养液中葡萄糖的含量，表明miR-106可增强葡萄糖异生。相反，miR-106抑制剂(antagomiR-106b)具有与miR-106模拟物相反的作用，表明抑制miR-106可抑制肝细胞葡萄糖异生活动(图2)。此外，miR-106对葡萄糖异生的调节作用伴随有STAT3蛋白表达的降低或升高(图3)。进一步研究发现，抑制STAT3活性可逆转miR-106b抑制剂(antagomiR-106b)对肝细胞葡萄糖异生的影响(图4)。这些结果表明，miR-106b通过抑制STAT3蛋白表达而促进肝细胞葡萄糖异生。

Fig. 4 Inhibition of STAT3 signaling abolished the inhibitory effects of antagomiR-106 on hepatic n=4)

Tab. 1 Inhibition of STAT3 signaling abolished the inhibitory effects of antagomiR-106 on hepatic n=4)

STAT3属转录因子的一员，参与对多种细胞细胞活动的调节。例如，激活的JAK2/STAT3信号通路具有抗心肌细胞凋亡的作用，也可影响急性胰腺炎的炎症反应[12-13]。在本研究中，STAT3通过与葡萄糖异生基因PEPCK和G6Pase调节区的相互作用，抑制这2个葡萄糖异生关键基因的表达，从而影响肝细胞葡萄糖异生活动，具体表现为激活的STAT3可抑制肝细胞葡萄糖异生[14-15]。既往研究也表明，STAT3的活性可受到其他因素的影响，如SirT1介导的STAT3关键赖氨酸位点的脱乙酰化可消除STAT3对肝细胞葡萄糖异生的抑制作用[16]。早期的研究已证实，STAT3的mRNA是miR-106b的直接靶标，miR-106b通过与STAT3 mRNA的3’UTR结合，从而降低细胞内STAT3的蛋白表达，包括内皮细胞和肝细胞内的STAT3蛋白表达[17-19]。与这些研究结果相一致，本实验的结果表明，miR-106b抑制剂可增强STAT3的表达，而其模拟物可降低STAT3的表达(图3)，证实miR-106b对STAT3的负调节作用。既然STAT3可抑制肝细胞葡萄糖的异生[14-15]，我们认为：miR-106b增加肝细胞葡萄糖异生的作用是通过抑制STAT3蛋白表达而完成的。

胰岛素在调节肝葡萄糖输出中的作用被广泛接受，胰岛素信号可通过直接或间接的方法控制肝细胞葡萄糖的异生[1]。其中，Akt起到至关重要的作用。磷酸化的Akt通过对FoxO1的调节控制葡萄糖异生基因的表达[1]。在本研究中，miR-106b模拟物(mimic)和抑制剂(antagomiR-106b)对细胞胰岛素信号分子PDK1和Akt的蛋白表达均不产生影响(图3)，表明miR-106b促进肝细胞葡萄糖异生的作用不依赖Akt的蛋白表达。而在肿瘤研究中，miR-106b可通过对PTEN的调节影响PI3K/Akt信号通路[20]。因此，miR-106b对胰岛素信号，尤其是对Akt和FoxO1的磷酸化的影响有待进一步的深入研究。有趣的是，研究表明STAT3是Akt信号的上游，激活的STAT3可增加Akt的磷酸化和活性[21]。因此有理由相信，miR-106b可能通过对STAT3蛋白表达的调控而影响Akt/FoxO1信号，从而调节肝细胞的葡萄糖异生活动。当然，这一假说需要更多的实验研究加以证实。

综上，本研究的结果表明miR-106b通过抑制STAT3的蛋白表达而增加肝葡萄糖异生作用。由于肝葡萄糖异生的增加在血糖升高中具有重要作用，因此本研究也为了解糖尿病患者血糖升高的分子机制提供了新的理论解释，同时为糖尿病的治疗提供了新靶点。