半乳糖凝集素-3在骨关节炎中作用的生物信息学分析

童也 王宇翔 徐海栋

【摘 要】目的：利用生物信息学方法分析半乳糖凝集素-3（gal-3）在骨关节炎中的作用机制。方法：从GEO数据库中下载经gal-3处理的骨关节炎软骨细胞芯片，寻找芯片表达谱的差异基因并对其进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析以及疾病富集分析。此外，利用STRING数据库和Cytoscape软件构建差异基因蛋白互作网络，寻找网络结构中的核心基因。结果：共筛选出474个差异基因，其中包含

246个上调的基因与228个下调的基因。GO富集分析结果表明，差异基因主要富集的生物学过程有骨髓白细胞迁移、白细胞趋化等;主要富集的细胞组分有细胞外基质、蛋白质细胞外基质等;主要富集的分子功能有细胞因子活性、趋化因子活性等。KEGG通路富集分析结果发现，差异基因主要涉及的通路有肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17信号通路等。疾病富集分析结果提示，差异基因主要富集的疾病有关节病、肺疾病、莱姆关节炎等。差异基因蛋白互作网络在Cytoscape软件共找出10个核心基因。结论：骨关节炎软骨细胞在gal-3作用下，可能通过上调白细胞介素-6等相关基因的表达在骨关节炎的进展中发挥重要作用。

【关键词】 骨关节炎;半乳糖凝集素-3;生物信息学;GEO数据库

Bioinformatics Analysis of the Role of Galectin-3 in Osteoarthritis

TONG Ye，WANG Yu-xiang，XU Hai-dong

【ABSTRACT】Objective：To analyze the mechanism of Galectin-3（Gal-3）in osteoarthritis by bioinformatics.Methods：Gal-3-treated osteoarthritis chondrocyte microarrays were downloaded from the GEO database，finding out the differential genes of microarray expression profiles to carry out GO function enrichment analysis，KEGG pathway enrichment analysis and disease enrichment analysis.In addition，the interaction network of differential gene proteins was constructed using database STRING and software Cytoscape to find the core genes in the network structure.Results：A total of 474 differential genes were screened，including 246 up-regulated genes and 228 down regulated genes.The results of GO enrichment analysis showed that the main biological processes of differential gene enrichment were bone marrow leukocyte migration and leukocyte chemotaxis;the main cell components were extracellular matrix and protein extracellular matrix;the main molecular functions were cytokine activity and chemokine activity.The results of enrichment analysis for KEGG pathway showed that the main pathways involved in differential genes were tumor necrosis factor signaling pathway and interleukin-17 signaling pathway.The results of disease enrichment analysis indicated that the main diseases of differential gene enrichment were arthropathy，lung disease，Lyme arthritis and so on.Ten core genes were identified in the interaction network of differentialgene  proteins by the software Cytoscape.Conclusion：Under the effect of Gal-3，osteoarthritis chondrocytes may play an important role in the development of osteoarthritis by up-regulating the expre-ssions of interleukin-6 and otherrelated genes.

【Keywords】 osteoarthritis;galectin-3;bioinformatics;GEO database

骨關节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的关节炎，主要特征为关节软骨退化及关节结构功能发生变化，是导致老年人慢性关节疼痛和致残的主要原因[1-5]。半乳糖凝集素-3（gal-3）是一种半乳糖结合蛋白，主要依赖碳水化合物的方式参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞因子分泌等多种生物学过程。

既往研究发现，在关节炎患者中，滑膜组织与软骨组织中gal-3的暴露水平升高，gal-3基于其促炎作用在关节炎疾病的发生、发展中发挥重要作用[6]。也有研究表明，gal-3在类风湿关节炎和OA患者的炎性滑膜中都有表达水平和分泌量的升高。此外，在实验性关节炎中，gal-3会加重关节的炎症反应以及关节结构的破坏。gal-3的缺失显著增加了脂多糖诱导的细胞活力下降。同时，脂多糖治疗明显促进细胞凋亡，而沉默gal-3则明显抑制脂多糖诱导软骨细胞凋亡，表明gal-3的缺失可保护软骨细胞免受脂多糖诱导的凋亡[7-8]。

虽然目前有大量研究证据表明，gal-3在OA的发生、发展过程中扮演重要的角色，然而，其具体的作用机制与潜在功能仍不明确。因此，本研究选取经gal-3处理的OA软骨细胞芯片，利用生物信息学方法分析OA软骨细胞的基因表达谱数据，探究其分子机制与潜在的生物学标志物，为今后OA的机制研究与临床治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 基因芯片数据的获取 基于NCBI的Gene Expression Omnibus（GEO）数据库，下载人OA软骨细胞芯片数据，芯片数据编号为GSE85254。下载的芯片数据集中包含经过50 g·mL-1的gal-3处理的OA软骨细胞实验组样本与未经特殊处理的OA软骨细胞对照组样本，实验组与对照组共8个样本。GPL15207为该芯片的平台文件。

1.2 芯片数据处理 原始芯片数据读入R软件中，利用affyPLM包中的RMA算法对数据做背景校正和标准化处理。表达谱数据中存在多个探针对应同一个基因的情况，通过取基因表达平均值的方法合并探针数据。在R软件Immpute包中，选用KNN（K-Nearest Neighbor）算法补充表达谱数据中的缺失值。最后，通过平台文件GPL16043将探针名注释为对应的基因名。

1.3 篩选差异表达基因 基于R软件中Limma包，对实验组与对照组之间的基因表达值通过双尾t检验计算P值，同时使用默认的BH（Benjamini and Hochberg）方法对P值进行校正。设置差异倍数|log2 Fold Change| > 1.5且校正后的P值adj.P.Val < 0.05作为差异基因的筛选条件。

1.4 差异基因的富集分析 利用R软件中的clusterProfiler软件包[9]，对上述得到的差异基因分别进行基因本体论（GO）生物学功能富集分析、京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析以及疾病富集分析。富集分析的过程中，校正后的P值adj.P.Val < 0.05认为该富集有统计学意义。

1.5 PPI网络构建与分析 基于STRING 11.0数据库（https：//string-db.org/），对差异基因进行蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析，设置最小有效结合分数为0.7。分析结果导入Cytoscape 3.6.1（https：//cytoscape.org/）软件中进行可视化。此外，利用Cytoscape 软件中的cytoHubba插件计算PPI网络拓扑结构中每个节点的度值（degree），节点的degree越高则表明该节点与越多其他的节点存在相互联系，进而说明高degree的节点在PPI网络结构中具有重要的枢纽作用。因此，将degree最高的前10个基因视为PPI网络中重要的基因，即核心基因（hub genes）。

2 结 果

2.1 差异基因筛选结果 预处理后的数据通过R软件中Limma包筛选实验组与对照组之间的差异基因，结果表明，共有474个差异表达基因，其中上调的基因有246个，下调的基因有228个。基于R软件中pheatmap包绘制了差异基因表达量热图，见图1。列出差异基因中变化最为显著的前10个上调与下调的基因，见表1。

2.2 差异基因富集分析结果 GO富集分析包括生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。GO富集分析结果表明，差异基因主要富集的BP有骨髓白细胞迁移、白细胞迁移的正调控、白细胞趋化、白细胞趋化的调控等;主要富集的CC有细胞外基质、蛋白质细胞外基质、膜区域等;主要富集的MF有细胞因子活性、趋化因子活性、G蛋白偶联受体结合等，对GO分析结果中BP、MF与CC的前10项进行可视化，见图2。KEGG通路富集分析结果则发现，差异基因主要涉及的通路有肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、IL-17信号通路、核转录因子（NF-κB）信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路等，对其结果进行可视化，见图3。疾病富集分析结果提示，差异基因主要富集的疾病有关节病、肺疾病、莱姆关节炎等，对其结果进行可视化，见图4。

2.3 PPI网络分析 差异基因蛋白互作网络结果在Cytoscape软件中进行可视化，见图5。利用cytoHubba插件计算PPI网络拓扑结构中节点的degree，degree前10的核心基因从高到低分别有IL-6、TNF、CXCL10、CXCL8、IL-1β、CXCL1、C3、CCL20、CXCL2、CCL2，见图6。

3 讨 论

慢性炎症是关节软骨退行性变的主要原因，其中，TNF-α、IL-1β等多种促炎性细胞因子以及生物力学因素参与慢性炎症的发展。多种致炎因素激活关节软骨细胞并产生大量一氧化氮，诱导软骨细胞凋亡、破坏软骨结构。在OA众多的发病机制中，软骨细胞被认为是OA的关键调控因子。先前已有研究表明，软骨细胞软骨变性与gal-3呈正相关，且gal-3增强了功能性OA标志物的表达[10]。

本研究选取OA软骨细胞芯片数据，将gal-3处理的软骨细胞样本作为实验组，与未处理的对照组软骨细胞样本进行比较，通过R软件共筛选出474个差异表达基因，其中上调的基因有246个，下调的基因有228个。在上调的差异基因中，差异最显著的前5个基因有IL-8、CXCL3、CCL20、CXCL5、CXCL2。这表明，gal-3主要通过炎性因子和趋化因子基因表达量的上调，从而加重软骨组织的炎症反应，进而加速关节软骨的破坏与OA疾病的进展，同时也提示我们，基因通常是以模块化或者网络化的形式共同发挥生物学作用的。先前的一项研究发现，OA软骨组织中CCL20蛋白表达量增加，此外，供体软骨细胞中CCL20 mRNA的表达虽然较低，但在促炎细胞因子刺激后表达升

高[11]。筆者发现的差异基因中CCL20显著上调，进一步印证了gal-3的促炎作用。

GO富集分析结果表明，差异基因主要参与的生物学过程有骨髓白细胞迁移、白细胞迁移的正调控、白细胞趋化、白细胞趋化的调控等。KEGG通路富集也发现，差异基因主要涉及的通路有TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路等。上述结果表明，在gal-3的影响下，OA软骨细胞内的炎性细胞迁移增加，炎性因子及趋化因子信号通路被激活，大量炎性细胞在趋化因子的作用下汇聚于病变的软骨组织，为软骨组织的破坏埋下隐患。针对差异基因的疾病富集分析结果提示，差异基因主要富集的疾病有关节病、肺疾病、莱姆关节炎等，这与笔者预期的结果相一致。

在STRING数据库与Cytoscape软件中，笔者构建了差异基因PPI网络，并利用cytoHubba插件找出了degree最高的10个核心基因，从高到低分别有IL-6、TNF、CXCL10、CXCL8、IL-1β、CXCL1、C3、CCL20、CXCL2、CCL2。既往研究表明，应用托珠单抗阻断IL-6受体可增加缺血性骨坏死小鼠的骨含量，与此同时，托珠单抗在分子水平上可促进缺血诱导后小鼠体内的软骨合成代谢和骨重建[12]。PANINA等[13]研究发现，与健康受试者相比，早期和晚期创伤性膝OA患者循环炎症因子IL-6的水平升高。我们寻找的核心基因中IL-6度值最高，联系先前的研究结果，进一步说明IL-6在OA中发挥重要的作用。

综上所述，gal-3在OA中主要发挥促炎作用，通过上调IL-6等相关基因的表达从而加重OA的疾病程度，在OA的进展中发挥至关重要的作用。

4 参考文献

[1] BLANEY DAVIDSON EN，VAN CAAM AP，VAN DER KRAAN PM.Osteoarthritis year in review 2016：biology[J].

Osteoarthritis Cartilage，2017，25（2）：175-180.

[2] MOBASHERI A，BAY-JENSEN AC，VAN SPIL WE，et al.

Osteoarthritis Year in Review 2016：biomarkers （biochemical markers）[J].Osteoarthritis Cartilage，

2017，25（2）：199-208.

[3] NEOGI T.The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage，2013，21（9）：1145-1153.

[4] VARADY NH，GRODZINSKY AJ.Osteoarthritis year in review 2015：mechanics[J].Osteoarthritis Cartilage，2016，24（1）：27-35.

[5] 中华中医药学会.骨性关节炎[J].风湿病与关节炎，2013，2（2）：71-72.

[6] HU Y，YELEHE-OKOUMA M，EA HK，et al.Galectin-3：A key player in arthritis[J].Joint Bone Spine，2017，84（1）：15-20.

[7] ARAD U，MADAR-BALAKIRSKI N，ANGEL-KORMAN A，et al.Galectin-3 is a sensor-regulator of toll-like receptor pathways in synovial fibroblasts[J].Cytokine，2015，73（1）：30-35.

[8] WANG JS，XIAO WW，ZHONG YS，et al.Galectin-3 deficiency protects lipopolysaccharide-induced chondrocytes injury via regulation of TLR4 and PPAR-gamma-mediated NF-kappaB signaling pathway[J].J Cell Biochem，2019，120（6）：10195-10204.

[9] YU G，WANG LG，HAN Y，et al.clusterProfiler：an R package for comparing biological themes among gene clusters[J].OMICS，2012，16（5）：284-287.

[10] WEINMANN D，SCHLANGEN K，ANDRE S，et al.Galectin-3 Induces a Pro-degradative/inflammatory Gene Signature in Human Chondrocytes，Teaming Up with Galectin-1 in Osteoarthritis Pathogenesis[J].Sci Rep，2016，16（6）：39112.

[11] ALAAEDDINE N，ANTONIOU J，MOUSSA M，et al.

The chemokine CCL20 induces proinflammatory and matrix degradative responses in cartilage[J].Inflamm Res，2015，64（9）：721-731.

[12] KAMIYA N，KUROYANAGI G，ARUWAJOYE O，et al.

IL-6 receptor blockade preserves articular cartilage and increases bone volume following ischemic osteonecrosis in immature mice[J].Osteoarthritis Cartilage，2019，27（2）：326-335.

[13] PANINA SB，KROLEVETS IV，MILYUTINA NP，et al.

Circulating levels of proinflammatory mediators as potential biomarkers of post-traumatic knee osteoarthritis development[J].J Orthop Traumatol，2017，18（4）：349-357.

收稿日期：2019-06-23;修回日期：2019-08-01