丙二醛氧化对籽瓜种仁蛋白质结构及功能特性的影响

高 瑾 Manonose - - 李志豪 -王 萍 余雄伟 - 李述刚 -

(1. 湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430000；2. 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；3. 武汉旭东有限公司，湖北 武汉 430000)

籽瓜(Citrulluslanatusvar)俗称“打瓜”，是西瓜(Citrulluslanatus)的变种，为葫芦科西瓜属植物，其种子常被称为西瓜子或黑瓜子。籽瓜种仁中蛋白质含量为36%～40%，其中必需氨基酸含量较为丰富，除赖氨酸外，其他几种必需氨基酸(如色氨酸、苯丙氨酸等)含量均符合或超过FAO推荐的比例[1-2]。

丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是一种活性醛类物质，能引起蛋白质、多糖、核酸等生命大分子的交联反应形成聚合物，同时可通过MDA含量了解脂质过氧化程度[3]。籽瓜种仁在加工、储藏等过程中极易受到光、氧、热等影响而发生脂质过氧化，MDA是油脂氧化过程中的一种重要的氧化产物，对其产品风味、营养等会产生较大负面影响。籽瓜种子中油脂的含量为45%左右，亚油酸、棕榈酸及硬脂酸是其主要成分[4]。籽瓜种仁蛋白质的研究主要集中在提取工艺、蛋白质组成及功能特性上[5]，而油脂氧化尤其是脂质氧化产物丙二醛对其蛋白质结构及功能性质方面的研究尚未见报道。

试验拟以籽瓜种仁蛋白质为研究对象，采用圆二色光谱、质构等技术揭示MDA氧化对籽瓜种仁蛋白质的结构特性及功能特性的影响，为籽瓜种仁蛋白质产品在实际工业生产中的精加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

籽瓜种仁：产地新疆；

透析袋：8 000～14 000 Da，美国Biosharp公司；

1,1,3,3-四甲氧基丙烷(1,1,3,3-Tetramethoxypropane, TMP)、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-l-naphthalcncsulfonic acid, ANS)：分析纯，美国Sigma公司。

1.1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机：Micro 21R型，美国Thermo Fisher公司；

傅里叶红外光谱仪：Nicoletis50型，美国Thermo Fisher公司；

圆二色谱仪：J-1500型，日本JASCO公司；

荧光分光光度计：F4600型，日本日立公司；

电泳仪：DYY-8C型，北京六一生物科技有限公司；

纳米粒度分析仪：Nano ZS型，英国Malvern公司；

扫描电子显微镜：SU-8010型，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 籽瓜蛋白的制备 参照毛晓英[6]的方法。

1.2.2 MDA的制备 通过水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMP)制备新鲜的MDA储备溶液[7]。将8.4 mL TMP与10.0 mL 5.0 mol/L HCl和31.6 mL去离子水混合，40 ℃ 暗处摇晃30 min，获得MDA，用6 mol/L NaOH将溶液pH调至7.4，储备溶液中MDA浓度通过吸光度在267 nm 处估算，摩尔消光系数值为31 500 L/(mol·cm)。

1.2.3 氧化籽瓜种仁蛋白质的制备 参照Wu等[7]的方法，将一定量的MDA与籽瓜种仁蛋白质溶液(50 mg/mL)混合，MDA终浓度梯度为0.00，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00 mmol/L，25 ℃密封避光条件下振荡24 h，透析24 h后冷冻干燥，于4 ℃贮存备用。

1.2.4 巯基和二硫键含量的测定 采用DNTB比色法[8]。

1.2.5 表面疏水性的测定 采用ANS荧光探针法[8]。

1.2.6 二级结构的测定 参照Wu等[7]的方法，将籽瓜种仁蛋白质上清溶液稀释成终浓度为50 μg/mL，利用MOS-450圆二色光谱仪进行检测。

1.2.7 傅里叶红外光谱分析 参考Liu等[9]的方法。在室温、干燥环境下将2 mg氧化籽瓜种仁蛋白质样品与200 mg KBr研磨混合均匀后压片。扫描波数400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数128次。

1.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳 参考Laemmli[10]的方法。将籽瓜种仁蛋白质样品溶于0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，使样品最终浓度为1.5 mg/mL，上样量10 μL。电泳凝胶板0.75 mm，初始电流10 mA，样品进入分离胶后电流25 mA。

1.2.9 粒径分布 参考Huang等[8]的方法。

1.2.10 微观结构 参照张海华等[11]的方法，取少量籽瓜种仁蛋白质样品过100目筛，采用扫描电子显微镜(SEM)进行观察。

1.2.11 持水性和持油性的测定 参考吴伟等[12]的方法。

1.2.12 凝胶特性的检测 利用超纯水将氧化后的蛋白质配置成90 mg/mL蛋白溶液，根据前期预试验调整布丁制作配方：0.25 g卡拉胶，0.09 g蔗糖脂肪酸酯，0.125 g果胶，4 g奶粉，3.5 g白砂糖，42.5 g氧化籽瓜种仁蛋白质溶液。将制作的布丁产品4 ℃下存放12 h后测其质构。测定模式为TPA模式[13]，探头型号SMS/P36R，测前速率5.00 mm/s，测试速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，停留时间10 s，下压形变40%，触发力5 g。

1.3 数据处理

试验结果表示为(平均值±标准偏差)，采用SPSS 17.0分析软件对数据进行显著性分析，利用Origin 2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 巯基和二硫键含量

由表1可知，随MDA浓度的增加，籽瓜种仁蛋白质总巯基含量下降，二硫键含量上升，可能是蛋白质氨基酸侧链在MDA作用下形成共价交联，导致巯基含量损失，二硫键数量及分布改变，与Wu等[4]的研究结果类似。因此，MDA氧化后的籽瓜种仁蛋白质结构发生变化。

2.2 表面疏水性

由图1可知，籽瓜种仁蛋白质表面疏水性随MDA终浓度的增大而减小(P<0.05)，可能是蛋白质构象在MDA氧化作用下先展开后又重新组合，导致亲水基团增加，疏水基团减少或者是蛋白质聚集，掩埋疏水基团，使其含量下降。王丹丹等[14]研究表明，核桃蛋白表面疏水性随氧化程度的加深逐渐降低。

2.3 圆二色光谱

由表2可知，氧化后的籽瓜种仁蛋白质的α-螺旋含量减少，β-折叠含量上升，β-转角及无规则卷曲含量下降，蛋白质的二级结构主要由氨基酸的局部序列和分子间不同部位的相互作用决定[15]，上述结果表明氧化会在一定程度上破坏籽瓜种仁蛋白质分子间的相互作用，进而改变二级结构。

表1不同浓度MDA氧化对籽瓜种仁蛋白质总巯基及二硫键含量的影响†

Table 1 Effects of MDA oxidation at different concentrations on the content of total sulfydryl group and disulfide bond of seeds-watermelon seed protein

MDA浓度/(mmol·L-1)总巯基/(Cund·mg-1)二硫键/(Cund·mg-1)0.0048.02±0.73d18.56±0.37a0.0146.06±0.50c19.55±0.25b0.1044.57±1.06b20.29±0.53c1.0043.20±0.94b20.98±0.47c10.0041.18±0.24b21.98±0.45c100.0039.70±0.18a22.73±0.39d

† 字母不同表示差异显著(P<0.05)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

Figure 1 Effects of MDA oxidation at different concentrations on surface hydrophobicity of seeds-watermelon seed protein

表2 不同浓度MDA氧化对籽瓜种仁蛋白质二级结构的影响†

† 字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 傅里叶红外光谱

2.5 凝胶电泳

由图3可知，在非还原情况下，35～260 kDa的条带浓度随MDA浓度的升高而增加；在MDA浓度为100.00 mmol/L时，高分子量聚集体在凝胶顶端发生积聚且逐渐加深，表明籽瓜种仁蛋白质受到氧化而产生聚集，且聚集程度随蛋白质氧化程度的加深而不断增加。Chen等[17]研究也发现，油脂氧化产物作用于大豆分离蛋白可导致非二硫键诱导的聚集产生，并认为这种聚集是由非二硫键的共价键引起的。因此，籽瓜种仁蛋白质在氧化过程中，分子量的改变也会对其结构产生影响，进而改变蛋白质的功能特性。

图2 不同浓度MDA氧化籽瓜种仁蛋白质的傅里叶红外光谱分析

Figure 2 Fourier infrared spectrum analysis of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.6 粒径分布

由图4可知，MDA氧化与天然的籽瓜种仁蛋白质粒径均呈单峰分布，峰值大多出现在 100.00 nm左右；当MDA浓度为1.00 mmol/L时，粒径增大至150 nm，可能是低浓度氧化诱使籽瓜种仁蛋白质形成了氧化聚集体，蛋白质粒径分布增大；当MDA浓度为100.00 mmol/L时，籽瓜种仁蛋白质溶液中一些较大的可溶性聚集体在共价和非共价键的直接相互作用下转变成不溶性组分，小的可溶性聚集体断裂为更小的小分子多肽，将氧化后的籽瓜种仁蛋白质溶液离心后，其粒径减小。由此表明MDA氧化促使籽瓜种仁蛋白质发生聚集，不可溶性蛋白质组分含量提高，蛋白质溶解度降低。

1. 蛋白Marker 2～7. 分别为100.00，10.00，1.00，0.10，0.01，0.00 mmol/L MDA氧化后的籽瓜种仁蛋白样品

图3 经不同浓度MDA氧化后籽瓜种仁蛋白质凝胶电泳图

Figure 3 Protein gel electrophoresis of seeds-watermelon seed protein after MDA oxidation at different concentrations

图4 不同浓度MDA氧化籽瓜种仁蛋白粒径分析

Figure 4 Particle size analysis of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.7 微观结构

由图5可知，未氧化的籽瓜种仁蛋白质显示出比较致密的结构，氧化后的结构较为疏松，且随MDA浓度的增大出现较多的颗粒状结构，可能是籽瓜种仁蛋白质的高级结构在氧化后会发生去折叠，分子间聚集，从而使表面结构改变[18]。

图5 不同浓度MDA氧化籽瓜种仁蛋白质的微观结构

Figure 5 The microstructure of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.8 持水性

由图6可知，籽瓜种仁蛋白质的持水性随MDA浓度的增大先下降后上升，但均高于天然籽瓜种仁蛋白质的。当MDA浓度较低时，籽瓜种仁蛋白质表面氨基酸残基与MDA接触并反应，使得籽瓜种仁蛋白质部分去折叠，疏水基团外露，持水性下降；随着MDA浓度的增大，籽瓜种仁蛋白质内部氨基酸残基被氧化修饰形成聚集体，水分子进入球蛋白内部，使持水性得到提高。故籽瓜种仁蛋白质在氧化后，其结构发生改变，而适度氧化有利于提高蛋白质的持水性，为其生产加工及储藏方面提供理论支撑。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

Figure 6 Effects of MDA oxidation at different concentrations on water-holding capacity of seeds-watermelon seed protein

2.9 持油性

由图7可知，籽瓜种仁蛋白质持油性随MDA氧化程度的增加先上升后下降，在MDA浓度为0.10 mmol/L时达最大。Wu等[7]研究发现MDA可与大豆分离蛋白内部氨基酸残基接触、反应，暴露疏水基团。因而，不同浓度MDA氧化使得籽瓜种仁蛋白质对油脂的吸附能力增加，但当MDA浓度较高时，籽瓜种仁蛋白质在MDA的作用下共价交联度增加，与油脂结合能力下降，导致持油性略微降低。故MDA氧化对籽瓜种仁蛋白质的持油性有一定的促进作用，可提高产品的风味品质。

2.10 凝胶特性的分析

由表3可知，籽瓜种仁蛋白质凝胶的硬度、咀嚼性随MDA浓度增大而减小，弹性在MDA浓度为0.10 mmol/L最好，恢复性变化不明显。这可能是籽瓜种仁蛋白质在加热条件下发生变性，其蛋白质结构展开并发生分子间交联，进而聚集形成凝胶[19]。因此，MDA氧化可在一定程度上破坏籽瓜种仁蛋白质凝胶特性的形成，进而影响其生产应用。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

Figure 7 Effects of MDA oxidation at different concentrations on oil-holding capacity of seeds-watermelon seed protein

表3 不同浓度MDA氧化对籽瓜种仁蛋白质凝胶特性的影响†

† 字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3 结论

随着MDA浓度的升高，氧化程度加剧，籽瓜种仁蛋白质结构由无序变为有序，出现明显的聚集现象；MDA氧化在一定程度上可提高籽瓜种仁蛋白质的持水性及持油性，而其凝胶特性逐渐被破坏，因此，不同浓度梯度MDA对籽瓜种仁蛋白质的凝胶特性会产生负面影响，进而影响其在凝胶加工过程中的应用。脂质过氧化反应较为复杂，代谢副产物较多，MDA为主要次生产物之一，脂质过氧化对籽瓜种仁蛋白质的影响机理有待进一步探讨。