液相色谱质谱对重组人生长激素-Fc（CHO 细胞）二硫键连接的确认

朱秋媚，王宇，刘涵，富瑞丽，刘莹，刘景会，顾建阳

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130062

二硫键（S-S 键）是通过蛋白质中两个半胱氨酸上的巯基（-SH）氧化而形成的，在稳定蛋白质构象和保持其活性方面起着重要作用［1］。重组人生长激素（recombinant human growth hormone，rhGH）-Fc 是由两个相对分子质量为22 125 的GH 与相对分子质量为50 280 的重链通过Linker 连接而成，重链之间通过两对链间二硫键形成同源二聚体［2］。抗体药物中二硫键的排布是对其结构特征的一种反映［3］，因此，二硫键连接的确认成为rhGH-Fc 结构确认过程中非常重要的一环。

液相色谱质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）作为一种分析工具，在蛋白质药物研发前期的结构表征、工艺优化、关键质量属性分析以及质量控制中有普遍应用［4］，LC-MS 能够精确测定多肽及蛋白质的相对分子质量，且通过二级碎片信息可解析肽段的氨基酸序列［5］，特别是蛋白质药物的二硫键确认和翻译后修饰分析，质谱的作用不可或缺［6］。基于质谱技术的分析方法能应用于蛋白质药物生产的各个阶段，提供蛋白质药物的一级序列信息（包括翻译后修饰）、高级结构分析以及构象研究等［7-8］。因此，本研究采用LC-MS 建立特异的方法，对rhGH-Fc 的二硫键进行解析。

1 材料与方法

1.1 样品 rhGH-Fc 为本公司制备。

1.2 主要试剂及仪器 盐酸胍购自美国Gibco 公司；碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）购自美国 Sigma公司；胰酶购自美国Promega 公司；乙腈（LC-MS 级）购自美国Honeywell 公司；甲酸（LC-MS 级）购自美国Fisher 公司；碳酸氢铵（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；超滤管购自美国Millipore 公司；AcQuity 液相色谱系统、色谱柱CSHC1（82.1 mm ×100 mm，130 Å，1.7 μm）、G2-XS 精确质量四级杆飞行时间（Q-TOF）液质联用系统和UNIFI 软件购自美国Waters 公司。

1.3 样品的制备 取 200 μL 样品，加入 600 μL 盐酸胍（8 mol ／ L），50 ℃水浴 0.5 h；取出放至室温，加入8 μL 碘乙酰胺（1 mol ／ L），避光 30 min；取上述样品加入超滤管中，13 201 × g 离心5 min，弃去滤过液，加入50 mmol ／ L NH4CO（3pH 8.0）缓冲液置换，离心操作10 次，最后用50 mmol ／ L NH4CO（3pH 8.0）缓冲液将蛋白浓度调节至0.3 mg ／ mL。分别按胰酶 ∶蛋白 1 ∶15 的比例加入胰酶，37 ℃酶解4 h。

1.4 液相色谱条件 色谱柱：CSHC1（82.1 mm×100 mm，130 Å，1.7 μm）；流动相 A：100%水（含 0.1%甲酸）；流动相B：100%乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.3 mL／min；柱温：65 ℃；上样量：5 μL；梯度洗脱表见表 1。

表1 液相梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution in LC

1.5 质谱条件 MSE采集模式；毛细管电压：2 500 V；Cone 电压：40 V；去溶剂气体温度：350 ℃；源温：120 ℃；去溶剂气体流速：600 L ／ h；一级质谱扫描范围：100 ~ 2 000 m ／ z。

2 结 果

确认到rhGH-Fc 中Fc 和rhGH 的正确二硫键连接。其中 1 ∶T6-1 ∶T16、1 ∶T20-1 ∶T21 为 rhGH 的链内二硫键，二硫键连接为：Cys53-Cys165，Cys182-Cys189，见图 1~ 图 6 和表 2。1 ∶T22-2 ∶T22 为 Fc 的链间二硫键，此肽段上有4 个半胱氨酸，形成2 组二硫键，二硫键连接为：1 ∶Cys210-2 ∶Cys210，1 ∶Cys213-2 ∶Cys213，见图 7~ 图 9 和表 2；1 ∶T24-1 ∶T29、1 ∶T36-1 ∶T41 为Fc 的链内二硫键，二硫键连接为：Cys245-Cys305，Cys351-Cys409，见图 10 ~ 图 15 和表 2。

图1 T6-T16 二硫键总离子流色谱图Fig.1 Chromatogram of total ion flow of T6-T16 disulfide bond

图6 T20-T21 二硫键的二级图谱Fig.6 Secondary profile of T20-T21 disulfide bond

图7 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫键总离子流色谱图Fig.7 Chromatogram of total ion flow of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

图9 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫键的二级图谱Fig.9 Secondary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

图10 T24-T29 二硫键总离子流色谱图Fig.10 Chromatogram of total ion flow of T24-T29 disulfide bond

图15 T36-T41 二硫键的二级图谱Fig.15 Secondary profile of T36-T41 disulfide bond

表2 通过软件确认的各组合物二硫键Tab.2 Disulfide bonds in various compositions confirmed by software

图2 T6-T16 二硫键的一级图谱Fig.2 Primary profile of T6-T16 disulfide bond

图3 T6-T16 二硫键的二级图谱Fig.3 Secondary profile of T6-T16 disulfide bond

图4 T20-T21 二硫键总离子流色谱图Fig.4 Chromatogram of total ion flow of T20-T21 disulfide bond

图5 T20-T21 二硫键的一级图谱Fig.5 Primary profile of T20-T21 disulfide bond

图8 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫键的一级图谱Fig.8 Primary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

图11 T24-T29 二硫键的一级图谱Fig.11 Primary profile of T24-T29 disulfide bond

图12 T24-T29 二硫键的二级图谱Fig.12 Secondary profile of T24-T29 disulfide bond

图13 T36-T41 二硫键总离子流色谱图Fig.13 Chromatogram of total ion flow of T36-T41 disulfide bond

图14 T36-T41 二硫键的一级图谱Fig.14 Primary profile of T36-T41 disulfide bond

3 讨 论

本研究采用Waters QTof 液质联用仪对rhGHFc 的二硫键进行解析，确认rhGH-Fc 中rhGH 的二硫键连接为 Cys53-Cys165，Cys182-Cys189；rhGH-Fc中 Fc 的二硫键连接为 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210，1 ∶Cys213-2 ∶Cys213，Cys245-Cys305，Cys351-Cys409，其中 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210 和 1 ∶Cys213-2 ∶Cys213 为 Fc 的链间二硫键，其他为链内二硫键，与理论信息一致。表明具有高分辨率和高准确度的LC-MS 技术可有效对蛋白一级结构表征进行分析［9-12］。

hGH 由人脑垂体前叶的嗜酸性细胞分泌，含有191 个氨基酸分子，相对分子质量为22 125，具有种属特异性，是人类出生后促生长最重要的一种蛋白质类激素［13］，正确的二硫键连接可影响其活性［14］。

Fc 片段是保持rhGH-Fc 在体内半衰期较长的主要因素，同时可影响蛋白稳定性［15］。由于rhGHFc 的链间二硫键易水解［16］，易形成单体，影响其结构和稳定性，对Fc 片段的二硫键进行鉴定显得尤为重要。

rhGH-Fc 被胰酶酶切成不同分子量大小的肽段，有半胱氨酸的肽段通过-S-S-连接成两个肽段，经质谱检测后能够获得含有-S-S-肽段的总离子流色谱图（total ion chromatograms）、肽段一级图谱和二级图谱，通过软件对这些肽段的图谱进行数据分析，鉴定到二硫键连接的位点。本研究无需对样品进行额外的标记，裸露出来的巯基可通过IAM 封闭，避免样品处理过程中产生错配的二硫键，且二硫键连接肽段无N 糖位点，仅通过对样品的酶解肽段进行分析，即可实现对样品二硫键连接的确认。

综上所述，本方法简单易用，能够快速、准确、有效地的确认rhGH-Fc 二硫键连接，也为其他融合蛋白的二硫键分析提供了思路。