60Co-γ辐照红参提取物对1型糖尿病小鼠的影响

齐 欣 崔承弼 - 金莉英 - 姜 欣 张 露

(延边大学，吉林 延吉 133000)

糖尿病已被列为威胁人类健康的重大慢性疾病之一，而糖尿病患者多因体内胰岛素分泌不足，不能有效地分解体内糖类物质，进而引发高血糖和尿糖等症状，多数患者还伴随脂代谢紊乱等症状，主要表现为血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)增高的高脂血症，糖尿病的出现会导致多种并发症，并难以控制，最终导致糖尿病患者病情进一步恶化[1]。近年来糖尿病已成为继癌症、心脑血管疾病后的第三类人类健康杀手。针对糖尿病，临床治疗手段主要还是通过药物、运动和饮食来控制其发展恶化[2]，截至目前仍未出现针对糖尿病迅速或彻底的治疗手段，常规西医主要通过补充胰岛素、增强胰岛素受体敏感性、减轻胰岛素抵抗作用和增强β细胞分泌、提升机体血糖耐受等途径来缓解糖尿病病情。但存在一定的副作用，可能造成乳酸中毒、肝细胞损伤、神经退行性病变、消化道不适及严重的低血糖等，甚至死亡，所以亟需更天然的治疗药物，如人参等天然药材[3-5]。

人参为五加科人参属多年生草本植物的根茎，是享誉华夏的千年古药。其具有多种祛病养生的生理功效，素有“百草之王”之美誉。随着其有效成分和药理病理活性与功能的不断研究，越来越多的专家学者[6-9]发现人参能够缓解糖尿病症状，具备辅助治疗糖尿病的巨大潜力。人参中具有多种对人体有益的活性成分，但其在储存和加工过程中易受微生物污染，因此需对其进行无菌处理。传统灭菌方法，如热处理和化学熏蒸法等会对环境和人体造成危害，而辐照技术应用范围广，相比传统灭菌方法，其杀菌效率高，并且节能、省时、成本低[10]。

60Co-γ射线辐照灭菌法，其穿透力极强，灭菌效果好，近年来在中药灭菌中得到越来越广泛的应用[11]。前期试验[12-13]发现，经15 kGy剂量的60Co-γ射线辐照，红参中降血糖相关人参皂苷Rh4和CK含量提升最显著，其中人参皂苷Rh4比未辐照前提升了74.89%，同时CK含量提升了59.42%。同时辐照处理也能提升人参的杀菌和贮藏效果[14]。试验拟以经15 kGy60Co-γ射线辐照红参和未辐照红参为研究对象，采用50%乙醇提取其活性成分并对1型糖尿病小鼠进行体内试验，研究15 kGy60Co-γ射线辐照红参和未辐照红参提取物对于糖尿病小鼠在血糖、血脂及糖化血红蛋白方面的改善能力，为辐照红参提取物在预防糖尿病方面的开发与利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物：体重为20～30 g的清洁级雄性昆明种小鼠，于适宜条件饲养，适应性喂养7 d后进行后续试验，延边大学动物实验中心。

1.2 试验材料及仪器

1.2.1 试验材料

小鼠饲料(配料表见表1)：延边大学动物实验中心；

红参：2016年产，长白山科学研究院提供，于四川省原子能研究院进行辐照处理；

链脲佐菌素：美国Sigma公司；

盐酸二甲双胍：河北山姆士药业有限公司；

柠檬酸、柠檬酸钠：AR级，天津市华东试剂厂；

表1 小鼠饲料配料表†[3]

† 能量16 857 kJ/kg。

总胆固醇(T-CHO)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、糖化血红蛋白(HbAlc)试剂盒：南京建成生物工程研究所；

医用酒精：上海金和实业有限公司；

正丁醇：AR级，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2.2 试验仪器

高速离心机：8O-2型，上海手术器械厂；

离心机：TG16A-WS型，上海卢湘仪器有限公司；

数控超声波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

旋转蒸发仪：SB-2000型，上海爱郎仪器有限公司；

分析天平：FA2004型，上海上平仪器有限公司；

立式鼓风干燥箱：DHG-9620A型，上海百典仪器设备有限公司；

血糖仪：AG-605型，天津九安医疗电子股份有限公司；

多功能荧光酶标仪：SP-Max3500FL型，上海闪谱生物科技有限公司；

电热恒温培养箱：DNP-9082型，上海精宏实验设备有限公司；

电子天平：Scout SE-SE202FZH型，奥豪斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红参提取物的制备 红参样品粉碎过80目筛后，以50%乙醇溶液按料液比1∶10 (g/mL)提取3次，40 kHz 超声提取3次，每次60 min，合并3次上清液，烘箱中80 ℃过夜后旋转蒸发至干，蒸馏水溶解后，以60 mL 水饱和正丁醇于分液漏斗多次萃取至上层有机层澄清，并合并上层旋转蒸发至干后以少量蒸馏水溶解置于-80 ℃冷冻后冻干得红参提取物。

1.3.2 血糖含量的测定 小鼠隔夜禁食12 h后(21时～次日9时)，进行剪尾取血，弃去第1滴尾尖血后检测血糖值，并记录。

1.3.3 糖尿病小鼠建模

(1) 将1.1中的小鼠在动物饲养室适应性喂养7 d后，随机选取6只作为空白试验组，对所有小鼠禁食处理，禁食方法为隔夜禁食不禁水12 h(21时～次日9时)。

(2) 测量并记录小鼠禁食体重及空腹血糖水平后，建立1型糖尿病模型，STZ浓度为12 mg/mL，空白组同时腹腔注射缓冲溶液做假性处理。

(3) 建模7 d后对各组小鼠禁食，空腹时称量体重，并测其空腹血糖值，建模成功标准：建模7 d后，小鼠空腹血糖值>11.1 mmol/L (200 mg/dL)，剔除建模失败小鼠。

1.3.4 受试物剂量设计 将血糖值>11.1 mmol/L(200 mg/dL)的小鼠随机分为6组，将辐照红参与未辐照红参提取物按表2中剂量配置，其中辐照人参提取物剂量依据预试验结果进行设置，分组和剂量设置见表2。

连续灌胃30 d，ⅰ、ⅱ组灌胃相同体积的蒸馏水，末次灌胃后进行眼球取血并脱颈处死，随后进行解剖。

1.3.5 小鼠全血HbAlc和血清TC、TG的测定 各组小鼠最后一次灌胃后进行眼球取血，处死并收集血浆至1.5 mL 离心管中，按照相应试剂盒使用方法，用酶标仪在固定波长下检测相应的吸光值，分别计算TC、TG和HbAlc含量。

表2 分组及剂量设置

2 结果与讨论

2.1 红参提取物对小鼠饮食及食物效价的影响

建模后，经过连续30 d灌胃试验后发现，试验组小鼠随着灌胃时间的延长，毛发由枯黄干燥变得浓密顺滑；ⅰ组小鼠在摄食量与摄水量上均无异常变化，模型组小鼠摄食量随着灌胃时间的延长呈现下降的趋势，其中与ⅱ组相比，α、λ和ⅲ组摄食量与摄水量明显减少，其食物利用率也明显提升，但α组数值更接近ⅲ组。由此可知，经红参提取物灌胃后均可有效改善小鼠状态，提高体重增量，提高食物效价。

表3 试验期间各组小鼠体重及摄食饮水情况†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 红参皂苷提取物对各试验组小鼠体重及血糖的影响

由图1可知，ⅰ组小鼠在饲养期间体重整体呈上升趋势，且体重增幅均远远超过其他各试验组；ⅱ组小鼠在灌胃期间体重呈不增长或负增长；ⅲ组和α、β、γ、λ组小鼠体重增降趋势基本一致，α组小鼠体重增幅仅次于ⅲ组，均优于其他各试验组，λ组小鼠体重增加量略高于β、γ组，而β组体重增幅又略高于γ组。说明在试验剂量范围内随剂量的增加，能够有效提高1型糖尿病小鼠的体重，且辐照人参高剂量组在改善小鼠体重方面好于未辐照人参高剂量组。

由表4可知，随着试验的进行，ⅰ组血糖水平略有升高，但保持在正常血糖范围内，ⅱ组血糖呈明显上升趋势，ⅲ组血糖水平呈先上升后下降的趋势，辐照人参提取物α、β、γ组和未辐照人参提取物λ组与ⅲ组趋势相同。第14天时，其余各组血糖水平均显著高于ⅰ组(P<0.05)；第24天时，其余各组血糖水平也均显著高于ⅰ组(P<0.05)，ⅱ组显著高于ⅲ组和α、β、γ、λ组(P<0.05)，α组显著低于β、γ、λ组(P<0.05)。说明二甲双胍阳性药和α、β、γ、λ组提取物悬浊液均对糖尿病小鼠的血糖上升有一定的缓解作用，且α组的降血糖效果优于λ组。第33天，ⅲ组仍显著高于ⅰ组(P<0.05)，同时ⅲ组显著低于α、β、γ、λ组(P<0.05)，α和λ组无显著差异(P>0.05)，但从空腹血糖值来看α组更接近ⅲ组。第43天时，ⅲ组与ⅰ组无显著差异(P>0.05)，α组和λ组无显著差异(P>0.05)，但从空腹血糖值来看仍是α组更接近ⅲ组。说明阳性对照组小鼠血糖值已基本恢复正常值，辐照高剂量组降血糖效果优于未辐照高剂量组。可见，辐照红参提取物能够起到降低糖尿病小鼠血糖的作用，并且辐照后的红参提取物好于未辐照的。

图1 辐照与未辐照红参提取物对各试验组小鼠体重的影响

Figure 1 Effects of irradiated and non-irradiated red ginseng extract on body weight of mice (n=6)

表4 试验各组小鼠血糖变化†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.3 红参皂苷提取物对小鼠血液相关指标的影响

由表5可知，从血清TC含量来看，ⅱ组显著高于ⅰ组和其余各组(P<0.05)，α组和ⅲ组无显著差异(P>0.05)，且α组显著低于λ组(P<0.05)。说明辐照红参高剂量组与未辐照红参高剂量组相比，在降低糖尿病小鼠血清TC含量的效果上更接近于二甲双胍。从血清TG含量来看，α组和ⅲ组无显著差异(P>0.05)，α组与λ组无显著差异(P>0.05)，但从TG含量来看，α组更接近于ⅲ组。说明辐照红参高剂量组降低糖尿病小鼠血清TG含量的效果更好。从糖化血红蛋白测定结果来看，α组和λ组测定结果较接近于ⅲ组，说明这两组小鼠的血糖控制情况较好。胰岛素的缺乏会导致摄入的脂肪等不能被人体利用，并且机体中的某些大分子物质，如脂肪分解的产物，游离脂肪酸进入肝脏，会生成甘油三酯和酮体，而脂肪组织中脂类的溶解使甘油三酯(TG)水平上升、同时由于高密度脂蛋白(HDL)水平的降低，从周围组织摄取胆固醇的能力降低，使机体胆固醇聚集水平升高，总胆固醇(TC)水平上升，而经辐照红参提取物灌胃后能够较好地改善TC、TG以及Hablc的水平。

表5 红参提取物对HbAlc、TC、TG的影响†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 红参皂苷提取物对小鼠脏器系数的影响

脏器系数(脏体比)指机体某脏器质量占体重的百分比。正常生长发育下的同一物种其机体各脏器与体重的比值较恒定。而在动物染毒或存在病理缺陷时，脏器发生氧化损伤或水肿、增生等，脏体比相应增大或减小，脏器系数随之改变，由此可来判断小鼠的健康状况。根据表6可知，各组间心脏脏器系数除ⅱ组显著升高(P<0.05)；肝脏脏器系数ⅱ组显著升高而经过不同剂量受试物干预后肝脏增生肥大情况得到显著改善(P<0.05)，其中α组和λ组恢复情况显著(P<0.05)高于其他组，仅次于ⅲ组；脾脏脏器系数ⅱ组与γ组显著高于其余各组(P<0.05),但彼此无显著差异(P>0.05)，α组脾脏器系数显著降低(P<0.05)且效果最优，表明15 kGy高剂量辐照红参提取物能显著缓解糖尿病小鼠脾充血肿大的状态，其效果接近于特定剂量的盐酸二甲双胍；糖尿病造成肾负担加重，表中显示ⅱ组肾脏肥大脏器系数显著高于其余各组(P<0.05)，经过不同剂量受试物干预后，α组和λ组肾脏脏器系数显著改善(P<0.05)，表明高剂量的红参皂苷提取物能显著恢复肾脏状态(P<0.05)。以上结果共同说明了高剂量15 kGy辐照红参皂苷提取物能显著改善心、肝、脾、肾的状态(P<0.05)。由此可知，辐照红参提取物可起到保护糖尿病小鼠脏器损伤的效果。

表6 红参提取物对各组小鼠脏器系数的影响†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

3 结论

试验初期发现经过15 kGy60Co-γ射线辐照的红参，其降血糖相关的人参皂苷Rh4及CK含量得到了显著提升，而后续的动物试验显示经过15 kGy60Co-γ射线辐照的高剂量红参皂苷提取物显著恢复了1型糖尿病小鼠的体重增长，降低了其血糖水平和饮水量以及摄食量，提升了食物利用率(P<0.05)，减少了其尿量，同时显著降低了HbAlc含量和血清TG和TC水平(P<0.05)，并显著恢复了心、肝、脾、肾脏器系数(P<0.05)。高剂量辐照后红参皂苷提取物在降低1型糖尿病小鼠血糖和缓解其并发症方面有较为明显的效果，对糖尿病有一定的辅助治疗作用。

试验仅研究了60Co-γ射线辐照红参对小鼠血糖及基础指标的影响，没有深入研究其降血糖机理，以及辐照后红参成分的变化，在后续的研究中将对糖尿病相关的蛋白进行测定，并研究辐照后红参成分的具体变化。