酶法制备元蘑蛋白肽及其分级组分抗氧化活性研究

栗铭鸿 - 姜伊悦 - 张小勇 - 崔福顺, -,

(1. 延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2. 延边大学食品研究中心，吉林 延吉 133002)

中国食用菌资源丰富，是食用菌生产大国，产量占世界首位；总产值在国内种植业中居第6位。食用菌含有丰富的蛋白质，可与肉、蛋以及豆类相媲美。肽类是介于蛋白质与氨基酸之间的一种生化物质，分子量比蛋白质小，更易被胃肠吸收而具有更多生物活性。食用菌源蛋白肽类的制备、理化性质及其免疫调节、抗氧化等功能活性已成为当前研究热点[1-4]；并已应用到功能保健食品以及医药等领域[5-6]。研究[7-8]也证实，肽类的功能活性依赖于其分子量大小、氨基酸组成及氨基酸排列顺序等。

元蘑是中国东北著名食用菌之一，味道鲜美，营养丰富。元蘑中含有蛋白质、维生素、氨基酸等营养物质；还含有酚类、多糖等活性成分；具有抗氧化、抗癌、抗辐射等功效作用[9]。目前国内外对元蘑的研究主要集中在元蘑多糖的提取、结构以及生物活性[10-12]，而对元蘑蛋白的研究鲜见报道。

课题组[13]12前期研究发现元蘑中含有多种生物活性成分，具有很好的抗氧化作用。试验拟以元蘑为原料，研究风味蛋白酶酶解制备元蘑蛋白肽工艺条件，并分析蛋白肽分级组分的氨基酸组成、红外特征及其体外抗氧化活性，为高值化元蘑蛋白产品的开发及综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

元蘑：购于吉林延吉；

风味蛋白酶：酶活1∶30 000，北京索莱宝科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、过硫酸钾、丁基羟基茴香醚(BHA)：分析纯，美国Sigma公司；

β-巯基乙醇：纯度≥99.0%，卡迈舒(上海)生物科技有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

离心机：TDZ5-WS型，湘仪离心机仪器有限公司；

氨基酸自动分析仪：L-8900型，日本日立集团；

傅里叶红外光谱仪：IRTracer-100型，日本岛津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质水解度DH测定 参照文献[14]。

1.3.2 元蘑蛋白质提取液制备 准确称取脱脂元蘑，以料液比1∶80 (g/mL)利用0.07 mol/L NaOH超声提取40 min，提取温度50 ℃，超声功率250 W；过滤后滤液用盐酸调至pH 4.0，4 000 r/min离心20 min；沉淀用蒸馏水复溶制得元蘑蛋白溶液，作为后续元蘑蛋白肽制备原液[15]。

1.3.3 酶解制备元蘑蛋白肽单因素试验 在预试验基础上选择风味蛋白酶为水解用酶。以水解度和DPPH·清除率为指标进行单因素考察。

(1) 温度对元蘑蛋白酶解效果的影响：固定pH 7.0、风味蛋白酶添加量5 000 U/g以及酶解时间4.0 h，考察温度分别为40，45，50，55，60 ℃条件下的酶解效果。

(2) pH值对元蘑蛋白酶解效果的影响：固定酶解温度50 ℃、风味蛋白酶添加量5 000 U/g以及酶解时间4.0 h，考察pH 7.0，7.5，8.0，8.5，9.0条件下的酶解效果。

(3) 酶解时间对元蘑蛋白酶解效果的影响：固定酶解温度50 ℃、pH 7.0以及风味蛋白酶添加量5 000 U/g，考察酶解时间分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h条件下的酶解效果。

(4) 加酶量对元蘑蛋白酶解效果的影响：固定酶解温度50 ℃、pH 7.0以及酶解时间4.0 h，考察风味蛋白酶添加量分别为3 000，4 000，5 000，6 000，7 000 U/g条件下的酶解效果。

1.3.4 响应面优化酶解制备元蘑蛋白肽工艺 在单因素试验的基础上，以DPPH·清除率为响应值，选择影响相对较大的因素，采用Box-Behnken进行响应面试验设计，优化酶解制备元蘑蛋白肽工艺条件。

1.3.5 元蘑蛋白肽分级 将元蘑酶解制得的酶解液在3.5，10.0 kDa透析袋中透析，收集3个组分，标记为P1(<3.5 kDa)、P2(3.5～10.0 kDa)及P3(>10.0 kDa)，分别冷冻干燥，制得元蘑蛋白肽3个分级组分。

1.3.6 氨基酸组成分析 称取样品置于水解管，加入6 mol/L HCl溶液，真空封口，110 ℃水解24 h后定容；取1 mL在100 ℃水浴蒸干，加2.5 mL 0.02 mol/L HCl溶解后进样测定。

1.3.7 傅里叶红外光谱分析 称取样品2 mg，以质量比1∶100加入溴化钾混合研磨压片。红外光谱采集分析软件为LabSolutions IR，扫描50次，分辨率0.25 cm-1，信噪比60 000∶1，波数范围4 500～450 cm-1。

1.3.8 抗氧化活性测定 DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、·OH清除能力和相对还原能力的测定参照文献[13]11-12。利用模糊数学的隶属函数值法进行抗氧化综合评价[16]。

1.3.9 模拟人工胃肠液对蛋白肽的影响 将元蘑蛋白肽配成0.05 mg/mL溶液，煮沸2 min，冷却后用1 mol/L的盐酸溶液调至pH 2.0，加入胃蛋白酶(占底物质量的4%)，37 ℃恒温反应1 h；用0.9 mol/L的NaHCO3溶液将pH值调至5.3，再用1 mol/L的NaOH溶液调pH值至7.0，加入胰蛋白酶(占底物质量的4%)，37 ℃恒温反应2.0 h，10 min沸水浴终止反应，冷却后取上清液，测定其DPPH· 清除率并代入式(1)计算活性保留率[17-19]。

(1)

式中：

B——活性保留率，%；

A1——不同条件处理后样品的清除率，%；

A0——蛋白肽原液的清除率，%。

1.3.10 数据处理 采用SPSS 20.0软件进行方差分析并进行LSD多重比较分析；红外光谱图采用Origin 6.1软件绘制。

2 结果与分析

2.1 元蘑蛋白酶解响应面优化

在单因素试验结果基础上，固定加酶量6 000 U/g，选择pH、酶解时间和酶解温度3个因素，采用Box-Behnken进行三因素三水平响应面试验设计，编码及水平见表1，试验设计与结果见表2。

采用Design-Expert 10软件对数据进行回归拟合，得到模型方程：

Y=26.898-1.464A+0.488B-1.157C+0.445AB-0.114AC+1.376BC-1.946A2-2.427B2-1.176C2。

(2)

表1 响应面分析因素与水平

表2 试验设计与结果

由表3可知，建立的二项多项模型极显著；失拟项不显著；相关系数R2=0.911，说明此模型可以很好地拟合试验结果。显著性表明，一次项A极显著，C显著，B不显著；二次项A2和B2极显著，C2不显著；交互项BC显著，AB和AC不显著。表明响应值的变化较复杂，各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系；影响的大小顺序依次为A>C>B。

图1为3个因素影响DPPH·清除能力的响应面和等值线图。通过软件分析得到的最佳酶解条件为pH 7.60，酶解时间2.90 h，酶解温度42.39 ℃，DPPH·清除率理论值可达27.45%。为了验证上述最佳条件，同时考虑操作可行性，选择酶解条件为：pH 7.6，酶解时间3.0 h，酶解温度42 ℃，验证实验(n=3)得到的DPPH·清除率为26.85%，与理论值基本吻合。

表3 统计分析结果

2.2 氨基酸组成分析

由表4可以看出，元蘑蛋白肽3个组分中均含有16种氨基酸，其中含有7种必需氨基酸(色氨酸未测)；都不含有半胱氨酸。同时，3个组分中谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸相对丰富，这些氨基酸参与蛋白质的代谢过程，有助脑部发育以及增强肝脏功能、降低血压等。与FAO推荐标准相比，组分P3中苯丙氨酸和苏氨酸含量高于FAO推荐标准；缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸含量与之相当，这些氨基酸具有改善记忆力和预防脂肪肝的作用[20]。葛晓鸣等[7]研究发现酶解肽的分子量大小不同时氨基酸组成也不同，抗氧化能力也不同。由表4还可以看出，元蘑蛋白肽3个组分中组分P3的总氨基酸和必需氨基酸含量最高，显著高于(P<0.05)组分P1和组分P2。因此，可以推测3个组分的抗氧化作用也会存在差异。

2.3 红外光谱分析

由图2可看出，P1、P2和P3的峰形和出峰位置基本一致，说明三者具有同样的官能团；3 414 cm-1处的极强吸收峰可能是N—H伸缩振动峰，属伯胺的特征吸收；2 929 cm-1处的吸收峰可能是CH2非对称性伸缩振动，属于酰胺B带；2 368 cm-1可能是三键和累积二键伸缩振动的吸收峰；1 637 cm-1处的强吸收峰可能是酰胺Ⅰ带(C═O伸缩振动)的β折叠，酰胺I带特征峰由多肽骨架的C═O伸缩振动在特定的氢键环境下引起的，其对二级结构变化十分敏感，是描述蛋白质二级结构的最主要峰[21]；1 404 cm-1处的吸收峰可能是C—N伸缩振动峰，属酰胺Ⅲ带；1 249 cm-1处的吸收峰可能属于蛋白质红外光谱的酰胺Ⅲ带的β折叠；1 035，1 076 cm-1处的强吸收峰可能是C—N伸缩振动峰，属脂酰胺的特征吸收；638 cm-1处的吸收峰可能是N—H伸缩振动峰。

图1 响应面及等值线图

表4 氨基酸组成†

† 同行字母不同表示差异显著(P<0.05)。

图2 红外光谱图

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除作用 如图3所示，随着浓度的增加，3个组分元蘑蛋白肽DPPH·清除能力均随之增大，浓度与清除率呈正相关；3个组分中P3清除能力(72.95%)显著高于(P<0.05)组分P1和组分P2。刘敏等[22]研究发现鲢鱼肽经超滤分成的3个组分中分子量大的组分DPPH·清除能力最好，与试验相似。

2.4.2 ABTS+·清除作用 如图4所示，随着浓度的增加，3个组分清除率均随之增大，浓度与清除率呈正相关；3个组分之间组分P3对ABTS+·清除能力最高(P<0.05)；其次为组分P1，组分P2最低；当浓度为10 mg/mL

字母不同表示不同样品之间差异显著(P<0.05)

时，组分P3的清除率最高(97.82%)。申彩红等[23]发现海参寡肽中小分子量(0.13～2.00 kDa)具有较好的ABTS+·清除能力；与试验结果不同，可能是蛋白来源不同，所用蛋白酶种类也不同，产生的多肽氨基酸序列不同，功能作用亦有差异。

2.4.3 ·OH清除作用 如图5所示，随着浓度的增加，3个组分·OH清除率也增大；浓度与清除率也呈正相关；3个组分之间组分P3的清除率显著高于(P<0.05)组分P2和组分P1。当浓度为20 mg/mL时，组分P3的清除率最高(60.99%)。张会翠等[24]发现花生肽3个组分中大分子量组分对·OH清除效果最差，与试验结果不同。说明不同来源蛋白肽分子量大小对·OH清除作用不同。

字母不同表示不同样品之间差异显著(P<0.05)

2.4.4 元蘑蛋白肽的相对还原能力 如图6所示，随着浓度的增加，3个组分相对还原能力也增加，呈明显的量效关系。3个组分中P3的相对还原能力显著高于(P<0.05)组分P2和组分P1；组分P2的还原力最差。当浓度为20 mg/mL时，P3组分相对还原能力达到97.55%。张会翠等[24]发现花生肽3个组分中低分子量具有较好的还原能力，与试验结果不同。Aderonke等[25]研究表明，同种物质经不同种类蛋白酶作用后，由于酶解位点不同，所得到的多肽氨基酸序列不同，产生同样分子量大小的多肽片段显现出不同的抗氧化效果。

字母不同表示不同样品之间差异显著(P<0.05)

2.4.5 综合抗氧化能力 利用隶属函数对不同分子量元蘑多肽抗氧化能力进行综合评价。以DPPH·、ABTS+·、·OH和相对还原力4个指标为依据，计算各指标的隶属函数值。经计算不同分子量元蘑多肽隶属函数值的平均值从大到小依次为组分P3(0.70)>P1(0.43)>P2(0.19)，说明不同分子量元蘑多肽中组分P3的综合抗氧化能力最好；其次为组分P1；组分P2最差。

生物活性物质的抗氧化能力与疏水性氨基酸和芳香性氨基酸具有较强的相关性。试验中不同分子量元蘑多肽的疏水性氨基酸和芳香性氨基酸含量较高；3个组分中组分P3的含量显著高于(P<0.05)组分P1和组分P2，也印证了组分P3具有最强的抗氧化能力，其次为组分P1，组分P2最差，与综合抗氧化能力顺序相符。但这一结论与其他学者[7,24,26]研究结果小分子肽具有比大分子肽抗氧化活性更好的结论不同。造成这一结果的原因，可能是元蘑中所含有的蛋白质经风味蛋白酶水解并透析分级后的组成不同；也有可能是分级组分中氨基酸含量的差异；还可能是有其他活性成分在起作用。有待于进一步分离纯化，并进行功能活性验证。

2.5 模拟人工胃肠液对元蘑蛋白肽稳定性的影响

图7为模拟胃肠道消化对3个组分元蘑蛋白肽稳定性的影响。经过1 h的胃蛋白酶作用后组分P1和组分P3的活性保留率保持在90%以上；组分P2的活性保留率达到106%。说明经过胃蛋白酶作用后，其抗氧化能力反而增强，可能在胃蛋白酶作用下，组分P2得到进一步酶解，产生更多具有抗氧化活性的多肽。胃蛋白酶作用后，再利用胰蛋白酶模拟肠道作用2 h，发现组分P1和组分P3的活性仍可保留在90%以上；而组分P2的活性保留率也在100%以上，说明胰蛋白酶将组分P1和组分P3进一步地酶解，抗氧化肽进而分解成其他功能肽，抗氧化活性减弱。经过模拟胃肠环境发现元蘑蛋白肽活性基本没有影响，并且可以增强组分P2的抗氧化能力，稳定性很好。张晶[17]通过模拟胃肠道对菜籽抗氧化肽发现，经过胃蛋白酶作用后抗氧化活性增强，但经胰蛋白酶作用后活性有一定程度上的减弱，活性下降至80%。

字母不同表示不同组分之间差异显著(P<0.05)

3 结论

利用风味蛋白酶对元蘑进行酶解制备元蘑蛋白肽，在固定酶用量为6 000 U/g条件下得到最佳酶解工艺为pH 7.6、酶解时间3.0 h、酶解温度42 ℃，该条件下酶解液对DPPH·清除率为26.85%。对元蘑蛋白肽进一步分级得到的3个组分P1(<3.5 kDa)、P2(3.5～10.0 kDa)和P3(>10.0 kDa)中均含有多种氨基酸；分子量最大的组分P3含有最多的总氨基酸和必需氨基酸；综合抗氧化结果也表明3个组分中大分子量的组分P3效果最好；清除效果与浓度呈正相关。同时还得出元蘑蛋白多肽分子量不同，氨基酸组成以及抗氧化能力也不同；分子量越大，含有疏水性氨基酸和芳香性氨基酸越多，抗氧化效果越好。红外光谱图结果表明，3个组分峰形和出峰位置基本一致，说明具有相同的官能团，二级结构稳定。模拟胃肠道消化结果表明，胃消化和肠消化作用对3个组分活性基本无影响。综上可以得出，元蘑蛋白中大分子量的蛋白肽氨基酸种类丰富，稳定性好，并具有很好的抗氧化作用，可以作为营养功能成分应用到食品加工中。而且食用菌来源不同以及蛋白肽分子量的大小不同时功能活性也呈现出不同的规律。

体外的功效作用并不能完全代表元蘑蛋白肽体内的生物活性。下一步将继续对体内相关活性展开深入研究，为元蘑高附加值产品的开发提供理论参考。