酸枣水提物不同提取工艺优化及抗氧化活性研究

施利奇 - 张彦青 -ng 戚务勤 -n 王 轻 解军波 -

(1. 天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；2. 天津中医药大学中药学院，天津 301617)

酸枣是中国华北地区的传统野生药用植物[1]，具有非常好的药用以及营养价值[2],是制作天然保健饮品的优质原料[3]。现代研究表明，酸枣果肉中营养物质主要包括多糖、有机酸、多种维生素以及矿物质等[4-5]，具有镇静催眠、抗氧化以及增强肠道屏障的作用[6-8]。目前，市场上酸枣饮料产品主要有酸枣汁[9]、酸枣果醋[10]、酸枣果酒[11]等，其中酸枣汁是最主要的品种。

酸枣果肉中通常含有大量的果胶和纤维物质，传统的枣汁生产主要采用热水浸提或打浆法，可溶物提取效率低，提取时间长等缺点[12-13]。近年来，众多研究学者[14-17]针对枣汁生产开发了多种提取方法，如超声法、微波法、酶解法等，与传统方法相比，这些方法可以使细胞内溶物更好地溶出，提取率明显提高。但迄今为止，采用超声联合酶解法提取酸枣汁，尤其是不同方法对酸枣可溶性物提取率及其抗氧化活性的影响研究还未见报道。

试验拟采用超声法、酶解法、超声辅助酶解法3种方法提取酸枣汁，以酸枣可溶性物提取率为指标，利用Box-Behnken响应面设计优化提取工艺，并考察不同工艺提取物的抗氧化活性，为深入开发酸枣资源、提高酸枣汁产品加工水平提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酸枣果肉：干制品，产地天津蓟县；

果胶酶(最适pH 4.0，温度50 ℃，酶活10万U/g)：河南万邦实业有限公司；

纤维素酶(最适pH 4.0，温度50 ℃，酶活5万U/g)：宁夏和氏璧生物技术有限公司；

柠檬酸：天津市光复科技发展有限公司；

DPPH、ABTS：美国Sigma公司；

其他试剂：分析纯，天津市化学试剂供销公司。

1.1.2 主要仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱：DH-101型，天津市中环实验电炉有限公司；

高速万能粉碎机：FW100型，北京中兴伟业仪器有限公司；

电子天平：ME204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

pH计：FE20型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

恒温水浴锅：TDA-8002型，天津市中环实验电炉有限公司；

数控超声波清洗器：KQ-500B型，昆山市超声仪器有限公司；

离心机：Heraeus Megafuge 8R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

折射计：PAL-1型，ATAGO(爱拓)中国分公司；

多功能读板机：SpectraMax-M5型，美国Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 称取干燥酸枣果肉2.0 g于50 mL离心管中，加入一定量的水，60 ℃浸泡1 h，酶解法和超声辅助酶解法需要用柠檬酸和pH计调节pH为4左右。

1.2.2 超声法提取工艺的优化

(1) 超声时间对提取率的影响：固定液料比7∶1 (mL/g)，超声温度50 ℃，超声功率100 W。分别在超声时间为10，20，30，40，50 min时提取酸枣果肉，考察超声时间对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(2) 超声功率对提取率的影响：固定液料比7∶1 (mL/g)，超声温度50 ℃，超声时30 min。分别在超声功率为100，120，140，160，180 W时提取酸枣果肉，考察超声功率对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(3) 超声温度对提取率的影响：固定液料比7∶1 (mL/g)，超声时间30 min，超声功率100 W。分别在超声温度为40，50，60，70，80 ℃时提取酸枣果肉，考察超声温度对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(4) 液料比对提取率的影响：固定超声温度50 ℃，超声时间30 min，超声功率100 W。分别在液料比为5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，13∶1 (mL/g) 时提取酸枣果肉，考察液料比对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(5) 响应面试验设计：在单因素试验基础上，选择有显著影响的4个因素，以酸枣果肉可溶性物提取率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，对酸枣果肉超声法提取工艺参数进行响应面试验优化。

1.2.3 酶解法提取工艺的优化

(1) 酶配比对提取率的影响：固定酶解温度50 ℃，加酶量2.1%，酶解时间1.5 h。分别在酶配比方式为水(A)、果胶酶(B)、纤维素酶(C)、果胶酶∶纤维素酶=1∶1(D)、果胶酶∶纤维素酶=1∶2(E)、果胶酶∶纤维素酶=2∶1(F)时提取酸枣果肉，考察不同酶配比对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(2) 液料比对提取率的影响：固定酶解温度50 ℃，酶解时间1 h，加酶量1.5%。分别在液料比为5∶1，7∶1，9∶1，11∶1，13∶1 (mL/g) 时提取酸枣果肉，考察液料比对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(3) 酶解温度对提取率的影响：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解时间1 h，加酶量1.5%。分别在酶解温度为40，45，50，55，60 ℃时提取酸枣果肉，考察酶解温度对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(4) 酶解时间对提取率的影响：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解温度50 ℃，加酶量1.5%。分别在酶解时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h时提取酸枣果肉，考察酶解时间对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(5) 加酶量对提取率的影响：固定液料比7∶1 (mL/g)，酶解温度50 ℃，酶解时间1 h。分别在加酶量为0.9%，1.5%，2.1%，2.7%，3.3% 时提取酸枣果肉，考察加酶量对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(6) 响应面试验设计：在单因素试验基础上，选择有显著影响的4个因素，以酸枣果肉可溶性物提取率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，对酸枣果肉酶解法提取工艺参数进行响应面试验优化。

1.2.4 超声辅助酶解法提取工艺的优化

(1) 液料比对提取率的影响：固定酶解温度和超声温度均为50 ℃、加酶量1.5%、酶解时间1 h、超声时间30 min、超声功率120 W。分别在液料比为7∶1，9∶1，11∶1，13∶1，15∶1 (mL/g) 时提取酸枣果肉，考察液料比对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(2) 加酶量对提取率的影响：固定酶解温度和超声温度均为50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，酶解时间1 h，超声时间30 min，超声功率120 W。分别在加酶量为0.9%，1.5%，2.1%，2.7%，3.3%时提取酸枣果肉，考察液料比对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(3) 酶解时间对提取率的影响：固定酶解温度和超声温度均为50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，超声时间30 min，超声功率120 W。分别在酶解时间为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h时提取酸枣果肉，考察酶解时间对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(4) 超声时间对提取率的影响：固定酶解温度和超声温度均为50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，酶解时间1 h，超声功率120 W。分别在超声时间为10，20，30，40，50 min时提取酸枣果肉，考察超声时间对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(5) 超声功率对提取率的影响：固定酶解温度和超声温度均为50 ℃，液料比9∶1 (mL/g)，加酶量1.5%，酶解时间1 h，超声时间30 min。分别在超声功率为100，120，140，160，180 W时提取酸枣果肉，考察超声功率对酸枣果肉可溶性物提取率的影响。

(6) 响应面试验设计：在单因素试验基础上，选择有显著影响的4个因素，以酸枣果肉可溶性物提取率为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，对酸枣果肉提取工艺参数进行响应面试验优化。

1.2.5 可溶性物提取率的测定 酸枣果肉提取后，离心(8 000 r/min，8 min)，得澄清酸枣汁，利用PAL-1型折光仪测定可溶性固性物含量，并按式(1)计算可溶性物质提取率。

(1)

式中：

c——可溶性物质提取率，%；

s——枣汁中的可溶性固性物含量，%；

m——酸枣汁质量，g；

M——酸枣果肉质量，g。

1.2.6 总酚含量的测定 采用福林酚法[18]，以没食子酸绘制标准曲线(曲线方程为y=0.002x+0.076，R2=0.999 0)，按式(2)计算总酚含量。

(2)

式中：

R1——酸枣汁中总酚含量，mg/g；

C——待测液总酚质量浓度，mg/mL；

V——澄清酸枣汁体积，mL；

当然，以上未列出的山西杰出学者尚多，仅清代就有孙嘉淦及徐润第、徐继畲父子等人。 而从三晋学术史或中国学术史的角度来看，以上所列学术团体及重要学人，皆对当时及后世的学术产生过一定的影响，其中皆有本省学者与外地名宦、寓贤交流互动的痕迹。

Y——可溶性固形物含量，%。

1.2.7 总糖含量的测定 采用苯酚硫酸法[19]，以葡萄糖绘制标准曲线(曲线方程为y=0.003 2x+0.151 9，R2=0.995 7)，按式(3)计算总糖含量。

(3)

式中：

R2——酸枣汁中总糖含量，mg/g；

C——待测液总糖质量浓度，mg/mL；

V——澄清酸枣汁体积，mL；

Y——可溶性固形物含量，%。

1.2.8 体外氧化活性测定 取3种方法所制备澄清酸枣汁，测定可溶性固形物含量，将酸枣汁稀释至浓度为6 mg/mL，进行体外抗氧化试验。分别测定其ABTS清除活性[20]、DPPH清除活性[21]以及羟自由基清除活性[22]。清除能力以每克可溶性固形物的VC微摩尔当量表示(μmol VC/g)。

1.3 数据处理

每个试验重复3次，采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，利用Prism软件、SPSS统计软件进行绘图和数据分析。

2 结果与分析

2.1 超声法提取工艺优化

如图1所示，最佳超声时间为40 min，最佳超声功率为140 W，最佳超声温度为70 ℃，最佳液料比为11∶1(mL/g)。因此，确定超声法响应面优化试验的因素及水平取值见表1，试验设计及结果见表2。

采用Design-Expert 8.0.6 软件对表2中的数据进行多元回归拟合分析，建立提取工艺的二次多项回归方程：

Y=66.41-0.025A+0.47B+0.37C+1.61D-0.53AB+0.37AC-0.43AD-1.18BC+0.12BD-2.50CD-1.46A2-1.10B2-1.07C2-2.34D2。

(4)

由表3可知，B、C、D均对酸枣水溶性物质提取率具有显著影响，各因素的影响大小为D>B>C>A。该模型具有极显著性(P<0.01)，失拟项P值不显著(P>0.05)，模型的相关系数R2=0.969 1，表明该模型拟合程度好，试验误差较小，该模型可用于预测试验结果。最佳条件为超声时间36 min，超声功率155 W，超声温度60 ℃，液料比13∶1 (mL/g)，按此条件进行验证实验，酸枣可溶性物质提取率为67.37%，与预测值(67.63%)相比，误差较小，能较好反映出各因素与酸枣可溶性物质提取率之间关系。

表1 超声法Box-Behnken试验因素和水平表

图1 超声法各单因素对酸枣可溶性物质提取率的影响

Figure 1 Effect of single factor on the extraction rate of sour jujube juice by ultrasonic method

表2 超声法响应面试验设计与结果

2.2 酶解法提取工艺优化

如图2所示，最佳酶配比为果胶酶与纤维素酶1∶2，最佳液料比为9∶1 (mg/mL)，最佳加酶量为2.1%，最佳酶解时间为1.5 h，最佳酶解温度为50 ℃。果胶酶和纤维素酶可以使酸枣细胞壁中的果胶和纤维素水解[23-24]组织结构松散，溶解出更多的可溶性物，从而提高提取率[25]。而且试验发现，胶酶∶纤维素酶为1∶2时酸枣可溶性物质提取率显著高于其他试验组。因此，酶解法和超声辅助酶解法均选择果胶酶∶纤维素酶为1∶2。确定酶解法响应面优化试验的因素及水平取值见表4，试验设计及结果见表5。

采用Design-Expert 8.0.6软件对表5中的数据进行多元回归拟合分析，建立提取工艺的二次多项回归方程：

Y=69.91+1.48A+0.94B-0.17C+0.24D+0.010AB+0.100AC-0.63AD+0.67BC-0.31BD-0.37CD-3.00A2-0.85B2-1.58C2-0.52D2。

(5)

表3 超声法方差分析结果†

† *表示有显著差异(P<0.05)；**表示有非常显著差异(P<0.01)；***表示有极显著差异(P<0.001)。

*. 显著差异(P<0.05) **. 非常显著差异(P<0.01) ***. 极显著差异(P<0.001)

表4 酶解法Box-Behnken试验因素和水平表

由表6可知，A、B对酸枣可溶性物质提取率具有显著影响，各因素的影响大小为A>B>D>C。该模型具有极显著性(P<0.01)，失拟项P值不显著(P>0.05)，模型的相关系数R2=0.968 3，表明该模型拟合程度好，试验误差较小，该模型可用于预测试验结果。最佳条件为液料比11∶1 (mL/g)，酶解温度47 ℃，酶解时间1.6 h，加酶量2.5%，按此条件进行验证实验，酸枣可溶性物质提取率为69.47%，与预测值(69.38%)相比，误差较小，能较好反映出各因素与酸枣可溶性物质提取率之间关系。

2.3 超声辅助酶解法提取工艺优化

如图3所示，最佳液料比为13∶1 (mL/g)，最佳酶解时间为1 h，最佳超声时间为30 min，最佳超声功率为140 W，最佳加酶量为2.1%。由于加酶量对提取率的影响变化较小，固定加酶量为2.1%。因此，确定超声法响应面优化试验的因素及水平取值见表7，试验设计及结果见表8。

采用Design-Expert 8.0.6 软件对表8中的数据进行多元回归拟合分析，建立提取工艺的二次多项回归方程：

表5 酶解法响应面试验设计与结果

表6 酶解法方差分析结果†

† *表示有显著差异(P<0.05)；**表示有非常显著差异(P<0.01)；***表示有极显著差异(P<0.001)。

表7超声辅助酶解法Box-Behnken试验因素和水平表

Table 7 Box-Behnken test factors and level tables by ultrasound-assisted enzymatic extraction method

编号A 液料比(mL/g)B 酶解时间/hC 超声时间/minD 超声功率/W-111︰10.520120013︰11.030140115︰11.540160

Y=74.62+0.37A+0.76B+0.016C+0.39D+0.092AB-0.36AC+0.049AD-0.64BC-0.39BD+0.099CD-1.20A2-0.62B2-1.39C2-0.26D2。

(6)

由表9可知，A、B、D均对酸枣可溶性物质提取率影响显著，各因素的影响大小为B>D>A>C。该模型具有极显著性(P<0.01)，失拟项P值不显著(P>0.05)，模型的相关系数R2=0.965 8，表明该模型拟合程度好，试验误差较小，该模型可用于预测试验结果。最佳条件为液料比13∶1 (mL/g)，加酶量2.1%，酶解时间1.2 h，超声时间29 min，超声功率146 W，按此条件进行验证实验，酸枣可溶性物质提取率为74.82%，与预测值(74.49%)相比，误差较小，能较好反映出各因素与酸枣可溶性物质提取率之间关系。

目前已报道酸枣汁提取方法主要为酶解法。毛丽衡[3]和杜琨[26]均采用果胶酶对酸枣进行提取，提取率分别为66.10%和67.23%。试验中3种方法的提取率(67.74%，69.38%，74.49%)均高于已报道酸枣提取率，与超声法和酶解法相比，超声辅助酶解法提取率明显提高，表明超声辅助酶解法是一种更加高效、方便的提取方法。

表8超声辅助酶解法响应面试验设计与结果

Table 8 Response surface design and results by ultrasound-assisted enzymatic extraction method

序号ABCD提取率/%1-1-10071.8721-10072.233-110073.014110073.73500-1-172.436001-172.66700-1172.898001173.529-100-172.4710100-173.2711-100172.9312100173.92130-1-1071.341401-1073.93150-11072.5516011072.5717-10-1071.501810-1072.9919-101071.9620101072.02210-10-171.9022010-174.61230-10173.8224010174.9825000074.6526000074.8027000074.42

图3 超声辅助酶解法各单因素对酸枣可溶性物质提取率的影响

表9 超声辅助酶解法方差分析结果†

† *表示有显著差异(P<0.05)；**表示有非常显著差异(P<0.01)；***表示有极显著差异(P<0.001)。

2.4 不同方法提取物总酚、总糖含量的比较

如表10所示，不同提取方法对酸枣汁中的总酚含量无显著影响，而对总糖含量影响显著；与超声法和酶解法相比，超声辅助酶解法可以显著提高酸枣汁中总糖含量。

2.5 酸枣汁抗氧化活性

如图4所示，3种方法提取的酸枣汁表现出较好的抗氧化活性。与超声法相比，酶解法可以显著提高酸枣汁清除羟自由基和DPPH自由基的能力，超声辅助酶解法显著提高酸枣汁清除ABTS自由基、羟自由基以及DPPH自由基的能力；超声辅助酶法酸枣汁DPPH自由基清除能力强于酶法(P<0.05)。由以上可知，超声辅助酶解法提取的酸枣汁抗氧化能力要优于其他两种方法，不同抗氧化能力可能与酸枣汁中总糖含量的差异有关。

表10 酸枣汁中总酚和总糖含量测定†

† 同列字母不同代表差异显著(P<0.05)。

字母不同代表差异显著(P<0.05)

3 结论

通过单因素试验和响应面法优化超声法、酶解法及超声辅助酶解法提取酸枣汁的工艺条件。结果表明，3种方法的酸枣水溶物提取率均优于已报道文献[3,26]的，其中超声辅助酶解法的提取效果最佳。酸枣汁具有明显的抗氧化能力，与其总酚、总糖含量密不可分，并且不同方法提取的酸枣汁抗氧化能力具有显著差异，可能与总糖含量的差异有关。与超声法和酶解法相比，超声辅助酶解法不仅可以有效提高酸枣可溶物提取率和总糖含量，还可以显著提高其抗氧化能力，因此超声辅助酶解提取可以作为一种高效的酸枣汁提取方法。后续将进行体内试验以进一步验证不同方法提取酸枣汁的抗氧化能力。