甘蔗花粉离体萌发研究
2019-12-14常海龙张伟陈俊吕郭育强方娜邱永生周峰吴建涛刘壮刘少谋王勤南
常海龙 张伟 陈俊吕 郭育强 方娜 邱永生 周峰 吴建涛 刘壮 刘少谋 王勤南
摘 要 為筛选适宜栽培种甘蔗花粉离体萌发的培养基配方，建立有效的离体萌发体系，以糖用甘蔗主栽品种ROC22花粉为材料，通过单因素试验探索满足甘蔗花粉离体萌发的基本条件，然后利用L16（45）正交试验，寻求甘蔗花粉离体萌发的最适宜培养基配方，在此基础上进一步探讨不同温度对甘蔗花粉萌发的影响。在单因素试验中，培养基以刚好凝固时为最佳。蔗糖、硼酸和硝酸钙在一定范围内对甘蔗花粉萌发起促进作用，超过一定浓度则起抑制作用。硫酸镁作用不稳定，硝酸钾影响较小。正交试验中，蔗糖对甘蔗花粉离体萌发率和花粉管生长速率影响最大，呈显著水平，硼酸次之，硫酸镁影响最小。花粉萌发的适宜温度为30 ℃，萌发率和花粉管长度分别为89.83%和143.03 μm。200 g/L蔗糖+400 mg/L硼酸+100 mg/L硝酸钙+400 mg/L硫酸镁+1 g/L琼脂，在30 ℃下培养花粉萌发率最高，花粉管生长状态良好，这种方法可快速有效鉴定不同甘蔗花粉活力差异。
关键词 栽培种;甘蔗花粉;离体萌发;正交设计中图分类号 S566.1 文献标识码 A
Sugarcane Pollen Germination in vitro
CHANG Hailong， ZHANG Wei， CHEN Junlyu， GUO Yuqiang， FANG Na， QIU Yongsheng， ZHOU Feng， WU Jiantao， LIU Zhuang， LIU Shaomou， WANG Qinnan*
Hainan Sugarcane Breeding Station， Guangzhou Sugarcane and Sugar Industry Institute / Guangdong Sugarcane Germplasm Resources and Utilization of Scientific Observation Test Station， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Sanya， Hainan 572025， China
Abstract The pollens of sugarcane cultivar ROC22 were used as the main experimental material to seek for the basic conditions of the pollen germinationin vitroby a single factor experiment， and the most appropriate culture medium formula was explored by an orthogonal experiment L16（45） in order to investigate the effects on sugarcane pollen germination under different temperatures. In the single factor experiment， the culture medium solidified slightly had the best effect. In certain range of concentration， sucrose， boric acid and calcium nitrate might promote pollen germination and inhibit pollen germination over the critical concentration. In addition， magnesium sulfate worked unsteadily， and the effect of potassium nitrate was little. In the orthogonal experiment， sucrose influenced significantly on the pollen germination ratein vitroand the pollen tube growth rate， boric acid took the second place， magnesium sulfate had little effect. The optimum temperature for pollen germination was 30 ℃， the pollen germination rate was 89.93% and the pollen tube length was 143.03 μm. It is concluded that， under 30 ℃， the pollen had the highest germination rate and the pollen tube grew well using the best culture medium formulas （200 g/L sucrose， 400 mg/L boric acid， 100 mg/L calcium nitrate， 400 mg/L magnesium sulfate and 1 g/L agar）， which might help to identify the difference of various sugarcane pollen efficiently.
Keywords cultivar; sugarcane pollen; germinationin vitro; orthogonal design
DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.022
自18世纪末Sotwedel和Harrison发现甘蔗在自然环境下开花结实以来，有性杂交一直是培育甘蔗新品种的主要途径[1]。但甘蔗花粉发育受外界环境影响，每年不同亲本间花粉活性差异较大，所配杂交组合中约25%的花穗结实率接近于零，这不但浪费劳动力，且不利于甘蔗杂交育种技术的持续发展。可见，甘蔗花粉的活性鉴定是杂交种质量与纯度的重要指标[2]。因此，为了提高甘蔗杂交结实率，配制亲本花粉活性强的优势组合，也为衡量甘蔗各品种（系）遗传雄性不育系不育程度及为甘蔗人工杂交授粉提供理论指导，有必要对其花粉生活力进行检测。花粉离体萌发因其数据可靠并完全定量而成为目前杂交育种中花粉生活力测定的首选方法[3]。
琼脂、蔗糖、硼酸、Ca2+、Mg2+和K+作为花粉离体培养的基本组成成分在蔗茅[4]、果梅[5]、小麥[6]、月季[7]等很多植物中均有应用，但不同植物花粉培养条件有一定的差异。甘蔗花粉属于典型的三核型花粉，外壁薄，对干燥敏感，其花粉生活力丢失速率是二核型花粉的2倍，离体后往往很快失去活力[8]，长期以来甘蔗花粉的离体萌发没有得到很好地解决。本文以甘蔗花粉为材料，在前期单因素试验基础上，采用正交设计研究花粉离体萌发的最适宜培养基成分，并研究了温度对甘蔗花粉萌发的影响，以期筛选出甘蔗花粉离体萌发的最适宜培养体系，为甘蔗花粉活力测定提供一个高效、快速、简便的方法。
1 材料与方法
1.1材料
本研究以海南甘蔗育种场ROC22为试验材料。2017年11月上旬花穗盛开期开始，提前1 d于傍晚时分把接近盛开的试材从茎中下部剪断，温室条件下于清水缸中培养。翌日清晨7点开始观察螽花开放时间，收集花粉，去除杂质装入密封塑料管中待用。
1.2方法
1.2.1 单因素试验 参照李富生等[4]关于蔗茅花粉的培养方法。分别对培养基组分中琼脂、蔗糖、硼酸、硝酸钙、硫酸镁及硝酸钾进行单因素试验（表1）;除蔗糖因子外，其他因子的试验均在150 g/L的蔗糖浓度下进行。
1.2.2 正交试验 在单因素试验的基础上，为探讨甘蔗花粉萌发和花粉管生长的最佳培养基配方，采用L16 （45）正交设计，研究培养基组分中蔗糖（A）、硼酸（B）、硝酸钙（C）硫酸镁（D）4个因素的各个水平对甘蔗花粉离体萌发的影响，因素水平安排见表2。
1.2.3 不同温度对甘蔗花粉萌发和花粉管伸长的影响 在筛选出最适蔗糖、硼酸、硝酸钙和硫酸镁浓度的基础上，利用最优培养基在培养温度为26、28、30、32 ℃下筛选出甘蔗花粉萌发和花粉管生长的适宜温度。
1.2.4 萌发率和花粉管长度的测定 花粉萌发以花粉管长度超过花粉直径为标准，在光学显微镜下观察花粉萌发及未萌发情况，并统计萌发率（同一视野中萌发的花粉占花粉总数的百分比）。每个玻片取3个视野统计萌发率，每个视野的花粉数不少于100个，每个处理统计3个玻片。
测定花粉萌发率的同时，选取已萌发的花粉，利用摄像系统截取图片，用Image-Prous 6.0图像分析软件测定花粉管长度，每个处理选取6个视野统计截图内所有萌发花粉管长度。
1.3数据处理
数据采用Excel软件绘制图表及SPSS13.0软件进行方差分析及多重比较。
2 结果与分析
2.16个单因素对甘蔗花粉萌发的影响
通过对琼脂、蔗糖、硼酸、硝酸钙、硫酸镁和硝酸钾的单因素试验结果表明，6个单因素对甘蔗花粉萌发都有一定影响，不同因素水平间变化不相同（图1）。琼脂对花粉萌发作用显著，呈现“倒V”型变化趋势，含量为0时花粉无萌发，1 g/L即培养基刚好凝固时花粉萌发率达最高值，之后随着琼脂质量浓度增加，萌发率急速降低，4 g/L时回落到无萌发状态。蔗糖质量浓度为0时，花粉无萌发，随着蔗糖质量浓度的增加花粉萌发率呈“抛物线”趋势增长，150 g/L时花粉萌发率增长趋势放缓，与200 g/L时花粉萌发率相比仅相差0.43%。推测，花粉萌发适宜蔗糖质量浓度在200 g/L左右。硼酸质量浓度为100～200 mg/L时花粉萌发率增长幅度较高，300 mg/L时花粉萌发率达最高值。硝酸钙质量浓度在0～300 mg/L时花粉萌发率呈指数增长趋势，之后缓慢降低。随着硫酸镁质量浓度增加花粉萌发率呈现“扁平M”态势，在100、300 mg/L时花粉萌发率较高，0、400 mg/L时花粉萌发率处于较低水平。硝酸钾对花粉萌发率影响较小，随着硝酸钾质量浓度增加花粉萌发率变化幅度较低，100 mg/L时花粉萌发率最高为10.85%，最低值为300 mg/L时的9.15%，两者相差仅1.70%。综上所述，甘蔗花粉萌发的适宜条件为：200 g/L蔗糖，300 mg/L硼酸，300～400 mg/L硝酸钙，100～300 mg/L硫酸镁，1 g/L琼脂，硝酸钾对花粉萌发影响极小，可忽略不计。
2.24因素正交试验对甘蔗花粉离体萌发的影响
在单因素试验基础上，为寻求蔗糖、硼酸、硝酸钙、硫酸镁的最佳组合，将新鲜甘蔗花粉接种在利用L16 （45）正交设计的培养基中（表3）。从表3可知，不同培养基上甘蔗花粉的萌发率不同。其中，组合10（A3B2C4D3）上的萌发率最高为85.52%，与最低组合1（A1B1C1D1）相差高达55.24%;组合12（A3B4C2D1）上的花粉管长度最高为112.27 μm，显著高于其他组合，且花粉管长度适宜，分布均匀。对表3的数据进行直观分析和方差分析，结果见表4和表5。
各因素内水平极差（R）的大小反映该因素对试验结果的影响程度，极差越大表明影响越大。由表4直观极差分析可知，参试的4个因素对花粉萌发率影响的主次关系依次：为A（蔗糖）>B（硼酸）>C（硝酸钙）>D（硫酸镁），蔗糖对花粉的萌发影响最大，硼酸次之，而硫酸镁影响最小。以甘蔗花粉的花粉管长度为衡量指标，各因素的极差大小顺序为A（蔗糖）>（B）硼酸>D（硫酸镁）>C（硝酸钙）。蔗糖对花粉管长度影响最大，硼酸次之，硝酸钙影响最小。由极差分析可知，蔗糖与硼酸浓度对甘蔗花粉萌发及花粉管生长最为关键。
由直观分析图2可知，花粉萌发率与花粉管长度都随着蔗糖浓度的升高出现先增加后降低的趋势;硼酸浓度升高花粉萌发率也出现先增加后降低的趋势。相反，花粉管长度是先降低后增加;硝酸钙浓度对花粉萌发率及花粉管长度影响不大，硫酸镁浓度仅对花粉管长度有影响，出现先降低后升高的趋势。由直观分析图可知适宜花粉萌发的最优组合为A3B2C1D4，即蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸钙100 mg/L、硫酸镁400 mg/L。适宜花粉管生长的最优组合为A3B2C1D2，即蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸钙100 mg/L、硫酸镁200 mg/L。对最优组合
A3B2C1D4和A3B2C1D2进行花粉离体萌发验证（图3），经统计分析确认2组合萌发率差异显著，花粉管长度差异不显著，且经A3B2C1D4培养的花粉管长度长短适宜，分布均匀。因此，从花粉萌发率和花粉管长度2方面综合考虑最优组合为A3B2C1D4。综上所述，甘蔗花粉离体萌发的适宜条件为蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸钙100 mg/L、硫酸镁400 mg/L。
由表5方差分析可見，蔗糖和硼酸对甘蔗花粉萌发率均达到显著或极显著影响，是甘蔗花粉萌发最关键因素，其他因素影响不显著;误差偏差平方和94.73远小于分析的蔗糖和硼酸偏差平方和，但大于硝酸钙和磷酸镁，推测甘蔗花粉离体萌发除了以上分析的4因素外，还存在其他一些影响因素，比如取材时间、操作技术及培养环境等。4因素中蔗糖对甘蔗花粉管伸长影响达到显著水平，其他因素不显著;但误差偏差平方和391.97远大于硼酸的272.70和硝酸钙的72.22，说明在影响花粉管伸长方面除了以上分析的4因素外还有其他因素对花粉管伸长起到重要影响，有待进一步分析。
2.3同温度对甘蔗花粉萌发和花粉管伸长的影响
花粉萌发是花粉细胞内一系列生化反应的结果，而适宜的温度是生化反应正常进行的基本条件之一。将甘蔗新鲜花粉接种在最优组合A3B2C1D4的培养基上，分别放置在26、28、30、32 ℃的培养箱中，2 h后统计萌发率和花粉管长度。由表6分析结果可知，不同培养温度对甘蔗花粉萌发率和花粉管长度都具有显著的影响。花粉萌发率和花粉管长度随着培养温度的升高而增加，当温度为30 ℃花粉萌发率和花粉管长度都达到最高，为89.83%和143.03 μm极显著高于其他培养温度。温度为28、32 ℃时花粉萌发率和花粉管长度差异不显著，但显著高于培养温度为26 ℃的萌发率。综上分析可知，甘蔗花粉萌发和花粉管正常生长的适宜温度为30 ℃，温度过高或过低均不利于甘蔗花粉的萌发。
3 讨论
3.1养基组分对甘蔗花粉萌发的影响
琼脂主要起到固化培养基的作用，不同植物花粉萌发所需琼脂浓度各有差异。王开良等[9]研究认为，余甘子花粉萌发适宜的琼脂浓度为20g/L;杜纪红等[10]认为桃花花粉萌发适宜浓度为10 g/L。本研究结果表明1 g/L的琼脂浓度对花粉萌发效果最好，低于1 g/L时培养基无法固化成型，花粉凹进培养基内部，萌发率降低且花粉管弯曲变形不易于统计比较。高于1 g/L时培养基硬度逐渐增大，花粉散落在培养基表面，透气性较好，但不利于花粉吸收营养成分，萌发率逐渐降低且花粉管较细，不健壮。
蔗糖对花粉的萌发和花粉管的生长具有明显的促进作用，一是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质，又是参与花粉代谢与跨膜运输的碳源[11];二是维持外界环境一定的渗透压[12]。浓度过低，花粉吸水，花粉壁破裂;浓度过高，花粉失水，导致花粉质壁分离抑制花粉萌发[13]。因此，蔗糖浓度必须控制在合理的范围之内。不同植物花粉所需浓度各有差异，应与品种遗传特性不同或花粉渗透压不同有关。罗凤霞等[14]研究表明，不同品种水仙花粉萌发所需的蔗糖浓度不一样，当蔗糖浓度为100～150 g/L时具有较高的萌发率;赵丽娟等[15]研究表明，小黑杨花粉萌发适宜的蔗糖浓度为150 g/L。本研究结果表明，蔗糖对甘蔗花粉萌发有极显著影响，在100～200 g/L时，随着蔗糖浓度增加，花粉萌发率及花粉管长度逐渐提高，当蔗糖浓度为200 g/L时，花粉管长度均匀、生长健壮、直立不弯曲，其萌发率也达到最高值，硼在植物体内含量很低，且分布不均匀，以花中含量最高，花中又以柱头和子房最多，硼离子与糖结合能够形成络合物，使糖易于通过质膜在组织中运输，增加氧的吸收，从而促进糖的吸收与代谢[16];硼还能参与果胶物质的合成，有利于花粉管壁的形成，因而有利于花粉管生长。不同植物种类的花粉萌发和生长所需的最适硼酸浓度不同，如紫丁香的最适浓度为600 mg/L[17]、麻疯树适宜的硼酸浓度为100 mg/L[18]。本研究结果表明，硼酸是甘蔗花粉萌发和花粉管伸长所必须的一种营养物质，对花粉的萌发有显著促进作用，甘蔗花粉萌发及花粉管伸长适宜的浓度为400 mg/L。
研究表明，Ca2+的动态变化对启动花粉萌发、调节花粉管伸长等环节具有重要作用[19-21]，花粉离体萌发时需要适当的外源Ca2+，缺钙或浓度过高都会导致花粉萌发和花粉管生长受阻[22-23]。在本研究中，硝酸钙的单因子和正交试验结果均表明，低浓度的硝酸钙对甘蔗花粉萌发有一定的促进作用，对花粉管长度的生长影响较小。甘蔗花粉离体萌发适宜的硝酸钙质量浓度为100 mg/L，硝酸钙质量浓度增加时抑制甘蔗花粉萌发和花粉管的生长，可见甘蔗花粉本身含有一定量的Ca2+，当花粉吸水时，表面钙离子释放到培养基中启动花粉萌发[24-25]。
3.2温度对甘蔗花粉萌发的影响
作为热带作物，甘蔗抽穗开花受温度影响较大，温度过高或过低都不利于花粉萌发。周峰等[26]研究认为夜间温度控制在25 ℃，10 h可明显促进甘蔗花芽分化;王丽萍等[27]通過对甘蔗光周期诱导处理后发现，孕穗期适宜提高温度可显著增加花粉量及花粉育性。本试验结果表明，甘蔗花粉萌发率和花粉管发育对温度十分敏感，26～28 ℃条件下花粉萌发率较低，花粉管生长缓慢;28～30 ℃条件下花粉萌发率逐渐增加，花粉管生长速度也较快;30～32 ℃条件下花粉萌发率逐渐降低，花粉管易弯曲打折影响统计分析，最适宜培养温度为30 ℃，花粉萌发率和花粉管长度最高，极显著高于其他培养温度，且花粉管直立，生长健壮，易于花粉生活力的比较分析。
综上所述，栽培种甘蔗花粉离体萌发培养方式为：培养基（蔗糖200 g/L+硼酸400 mg/L+硝酸钙100 mg/L+硫酸镁400 mg/L+琼脂1 g/L），置于30 ℃恒温培养箱内湿润环境下培养效果最佳，可快速、准确鉴定甘蔗花粉活力。
参考文献
[1] 骆君骕. 甘蔗学[M]. 广州： 中国轻工业出版社， 1984：156-220.
[2] 李奇伟， 陈子云， 梁 洪. 现代甘蔗改良技术[M]. 广州：华南理工大学出版社， 2000： 19-42.
[3] 左丹丹， 明 军， 刘 春. 植物花粉生活力检测技术进展[J]. 安徽农业科学， 2007， 35（16）： 4742-4745.
[4] 李富生， 林位夫， 何顺长， 等. 不同无性系蔗茅抽穗开花特性的观察和花粉贮藏条件的研究[J]. 植物生理学通讯，2005， 41（2）： 171-174.
[5] 杜玉虎， 张绍铃， 姜雪婷， 等. 果梅花粉离体萌发及花粉管生长特性研究[J]. 西北植物学报， 2006， 26（9）：1846-1852.
[6] 朱展望， 张改生， 牛 娜. 小麦花粉的离体萌发研究[J].麦类作物学报， 2007， 27（1）： 12-15.
[7] 王岚岚， 游 捷， 俞红强. 月季花粉离体萌发液体培养基组分的优化[J]. 河北农业大学学报， 2008， 31（3）：42-45.
[8] 周耀辉， 黄启尧， 杨业后. 甘蔗花粉低温贮存与生活力[J].甘蔗糖业， 1994（2）： 7-10.
[9] 王开良， 姚小华， 任华东， 等. 余甘子花粉萌发与贮藏特性研究[J]. 江西农业大学学报， 2006， 28（1）： 69-73.
[10] 杜纪红， 叶正文， 苏明申， 等. 桃花粉离体萌发和花粉管生长特性研究[J]. 西北植物学报， 2011， 31（1）： 64-71.
[11] Fei S， Nelson E. Estimation of pollen viability， sheddingpattern， and longevity of creeping bentgrass on artificial media[J]. Crop Science， 2003， 43（6）： 2177-2181.
[12] Feruzan D， Goksel O， Ozlem D. In vitro pollen germinationof some plant species in basic in basic culture medium[J]. Journal of Cell and Molecular Biology， 2004， 3：71-76.
[13] 金爱红， 褚立民， 徐东青， 等. 钙对葱兰花粉萌发和花粉管生长的影响[J]. 湖北农业科学， 2005（3）： 91-93.
[14] 罗凤霞， 周 威， 杨春起， 等. 水仙花粉离体萌发温度和培养液研究[J]. 辽宁林业科技， 2007（5）： 13-14， 25， 57.
[15] 赵丽娟， 李淑娟， 于金海， 等. 小黑杨花粉离体萌发和细胞学分析[J]. 林业科学， 2011， 47（6）： 36-41.
[16] 潘瑞炽. 植物生理学[M]. 4 版. 北京： 高等教育出版社，2001： 31， 260.
[17] 刘雪莲， 李庆玲， 秦佳梅， 等. 不同培养基对紫丁香花粉离体萌发的影响[J]. 东北林业大学学报， 2010， 38（7）：61-63.
[18] 蒲光兰， 周兰英， 李瑾宵， 等. 温度、蔗糖和硼酸对麻疯树花粉离体萌发的研究[J]. 西北林學院学报， 2011， 26（3）：55-58.
[19] Zhao J， Yu F， Liang S， et al. Changes of calcim distributionin egg cells zygotes and two-celled pro-embryos of rice（Oryza sativa L.）[J]. Sexual Plant Reproduction， 2002， 14（6）：331-337.
[20] Tian H Q， Zhang Z， Russell S D. Isolation of the male germunit organization and function in tobacco （Nicotana tabacumL.）[J]. Plant Cell Reports， 1998， 18： 143-147.
[21] Zhang Z， Tian H Q， Russell S D. Localization of myosin onsperm-cell-associated membranes of tobacco （Nicotana tabacunL.）[J]. Protoplasma， 1999， 208： 123-128.
[22] 垄 明， 曹宗巽. 钙和钙调素对花粉萌发和花粉管生长的调控[J]. 植物生理学通讯， 1995， 31（5）： 321-328.
[23] 孙 颖， 孙大业. 花粉萌发和花粉管生长发育的信号转导[J]. 植物学报， 2001， 43（12）： 1211-1217.
[24] Tian H Q， Kuang A， Musgrave M E， et al. Calcium distributionin fertile and sterile anthers of a photoperiod-sensitivegenic male-sterile rice[J]. Plana， 1998， 204（2）： 183-192.
[25] Heslop-Harrison J. Pollen germination and pollen-tubegrowth[J]. International Review of Cytology， 1987， 107：1-78.
[26] 周 峰， 胡后祥， 金玉峰， 等. 夜间温度对光周期诱导甘蔗开花的影响[J]. 西南农业学报， 2013， 26（1）： 99-102.
[27] 王丽萍， 马 丽. 提高甘蔗远缘杂交后代花粉育性的研究[J]. 亚热带农业研究， 2005， 1（1）：1-3.
