龙眼HD-Zip基因家族生物信息及表达分析
2019-12-14张春渝徐小萍陈晓慧申序林玉玲赖钟雄
张春渝 徐小萍 陈晓慧 申序 林玉玲 赖钟雄
摘 要 為了解龙眼HD-Zip基因家族的功能，本研究基于龙眼基因组与转录组数据库，对提取的19个龙眼HD-Zip家族成员的启动子、可变剪接以及受到调控的miRNA种类进行分析;并采用实时荧光定量PCR技术，分析了在ABA处理下龙眼胚性愈伤组织（embryonic callus，EC）中HD-Zip部分成员的表达模式，以及HD-Zip部分成员在不同体胚阶段的表达模式。结果表明：龙眼HD-Zip家族除含有TATA-box和CAAT-box以外还含有大量的光响应元件、激素响应元件以及胁迫响应元件，暗示龙眼HD-Zip家族成员可能参与光反应、激素响应以及非生物胁迫的过程;龙眼HD-Zip在不同组织部位与不同体胚阶段的可变剪接方式主要以内含子保留为主;龙眼HD-Zip基因家族成员主要受到miRNA166a的调控;在外源激素ABA处理下龙眼EC中HD-Zip家族部分成员的表达模式以及部分成员在不同体胚阶段的表达模式都呈现多样化，推测龙眼HD-Zip参与龙眼不同体胚发育的调控，并且可能通过调节内源ABA的浓度进而影响胚性愈伤组织的生长发育以及形态的建成。
关键词 龙眼;HD-Zip基因;体胚;表达模式中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Biological Information and Expression Analysis of HD-ZipGene Family in Dimocarpus longan Lour.
ZHANG Chunyu， XU Xiaoping， CHEN Xiaohui， SHEN Xu， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract In order to understand the function of the longanHD-Zipgene family， this study was based on the longan genome and transcriptome database， and analyzed the promoters， alternative splicing and regulated miRNA species of 19 longanHD-Zipfamily members， and the expression pattern ofHD-Zipmembers in longan embryogenic callus under ABA treatment and the expression patterns of some members at different somatic stages was analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR. The longanHD-Zipfamily contained a large number of photoresponsive elements， hormone response elements and stress response elements in addition to TATA-box and CAAT-box， suggesting that longan HD-Zipfamily members may be involved in photoreactivity， hormone response and non-biological stress. The alternative splicing mode of longanHD-Zipin different tissue parts and different somatic embryo stages was mainly intron retention. The longanHD-Zipgene family members were mainly regulated by miRNA166a. The expression patterns of some members of theHD-Zip family in the longan EC stage under the treatment of exogenous hormone ABA and the expression patterns of some members in different somatic embryo stages were diverse. It is speculated that longanHD-Zipparticipates in the regulation of different somatic embryo development in longan， and may affect the growth and development of embryogenic callus and the formation of morphology by regulating the concentration of endogenous ABA.
Keywords Dimocarpus longan Lour.;HD-Zipgene; somatic embryo; expression mode
DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.004
HD-Zip（同源异型-亮氨酸拉链）蛋白是植物中特有的一类转录因子，属于同源异型盒（homeobox，HB）蛋白家族。它包含有一个高度保守的同源异型结构域（HD）和一个亮氨酸拉链（LZ）结构域。HD-Zip蛋白可以根据结合的特异性DNA序列、基因结构、包含的其他基序以及功能等4个方面，分成4个不同的亚家族[1-2]。近年来，HD-Zip已经在多种植物中有所报道，如大豆[3]、桃[4]、番茄[5]等。HD-Zip基因家族在植物的生长发育中，发挥着多样的功能，HD-ZipⅠ通常参与非生物的应激反应、脱落酸合成的有关过程;HD-ZipⅡ有参与调节生长素、诱导避荫反应的功能;HD-ZipⅢ通常参与调控顶端分生组织;HD-ZipⅣ在花青素的积累、根系发育中起着重要的作用[2， 6-10]。同时，HD-Zip在胚胎发育的过程中，也起到了重要作用。据2017年的报道称，HD-Zip基因的4个亚家族中，均有成员参与了胚胎的发育[11]。在HD-ZipⅠ中发现其成员的单个突变体不会引起任何胚胎发育的缺陷，但是这些突变体和胚胎发育中存在的激素却有着一定的关系[12];在紫花苜蓿中發现，其愈伤组织经过噻唑隆处理后胚性能力受到抑制，可能是通过调控MSHB1（HD-ZipⅡ）介导的[13];在落叶松中发现HD-ZipⅢ的4个成员参与了体细胞胚胎的发育[14];玉米HD-ZipⅣ家族成员能够在胚胎发育期间在定义表皮不同区域中起作用[15]。可见HD-Zip各亚家族成员都在胚胎发育中起着各自的作用。
龙眼（Dimocarpus longanLour.）属于无患子科龙眼属，是一种重要的热带、亚热带木本果树，其胚胎发育与龙眼的生长情况、果实产量以及果实品质息息相关。但是由于龙眼童期长、遗传上高度杂合[16]，致使早期胚胎合子胚的采样和观察都比较困难，而利用本实验室构建的龙眼体胚发生体系可以克服这些困难，通过研究龙眼体胚的发生体系进而分析龙眼的胚胎发育情况，有助于更好地了解龙眼的胚胎发育机制。当前，龙眼的胚胎发育是一个研究的热点，近年来多有报道[17-18]。目前虽有关龙眼HD-Zip家族的全基因组鉴定[19]，但其在龙眼胚胎发育中的作用却尚未见深入分析。因此有必要对龙眼HD-Zip家族的功能进行研究，进一步了解HD-Zip在龙眼胚胎发育中的重要作用。
可变剪接（alternative splicing，AS）方式常见的有5种类型，包含外显子跳跃、互斥外显子、3′端可变剪接、5′端可变剪接以及内含子保留[20]。其中内含子保留是植物中最常见的可变剪接方式[21]。据报道，AS可能参与植物中重要的功能，比如应激反应，并且可能影响植物的驯化以及性状选择[22]。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小RNA，调节植物和动物的基因表达，参与多种生物学过程，从器官分化到生物和非生物应激反应[23]。其在HD-Zip家族中的研究也取得了一定的进展，如在白杨中，PtaHB1的表达量与Pta-miR166的水平呈现负相关[24];在白花中，miRNA166与miR319在冷胁迫下于幼苗中上调表达，而它们的靶基因HD-ZipⅢ与GAMyb-like均呈现下调表达[25]，脱落酸（ABA）是一种重要的植物激素，在拟南芥HD-Zip家族的研究中发现，通过ABA诱导的ATHB12负调节花序茎中赤霉素（GA20）氧化酶基因的表达[26]。同时，值得关注的是，AS、miRNA、ABA都在胚胎发育过程起到了重要的作用：近期的研究发现，在拟南芥中，AtBUD13基因通过影响pre-mRNA剪接，在早期胚胎发育中发挥着关键的作用[27];miRNA在拟南芥的体细胞发生过程强烈表达[28];ABA在郁金香的鱼雷形胚胎成熟和成熟体细胞胚的转化过程中起着重要作用[29]。本文通过对龙眼HD-Zip基因家族的启动子顺式作用元件、可变剪接事件、miRNA的预测，采用实时荧光定量PCR技术，对在外源激素ABA处理下龙眼HD-Zip家族部分成员在胚性愈伤组织中的表达模式，以及部分成员在不同体胚阶段的表达模式进行分析，进而研究龙眼HD-Zip潜在的生物学功能，以期为研究HD-Zip在龙眼体胚发育机制中的作用提供参考。
2.1.1 龙眼HD-Zip光响应功能元件分析 在龙眼HD-Zip基因家族启动子顺式作用元件中，光响应功能元件的数目最多。每个基因家族成员都含有光响应功能元件，但包含的数量不尽相同，个数介于2～15。具有光响应功能的顺式作用元件的种类丰富，包含ACE、I-Box、Box4、G-Box、G-box等一系列顺式响应元件，共含22种（图3）。在22种光响应顺式作用元件中，Box4与G-box出现的频率最高，二者都存在于15个成员中，但是各自存在的成员并不是完全相同的，其中既存有Box4又存有G-box顺式作用元件的成员有12个。特别的是，在这些光响应顺式作用元件中，有些成员存在自身特有的光响应顺式元件，其中3-AF1 binding site为DLHB4-6特有的光响应顺式元件;CAG-motif為DLHB1-1特有的光响应顺式元件;AT1-motif为DLHB4-9特有的光响应顺式元件;ATCT-motif为DLHB1-3特有的光响应顺式元件;GA-motif为DLHB4-8特有的光响应顺式元件。可见，龙眼HD-Zip成员包含的具有光响应功能的顺式元件虽在种类上存在一定的相似性，但
同时又有一定差异，猜测龙眼HD-Zip基因家族成员对光的响应程度有所不同。
2.1.2 龙眼HD-Zip激素响应功能元件分析 在龙眼HD-Zip基因家族中包含5种类型的激素响应元件。具体包括脱落酸响应元件（ARE），赤霉素响应元件（P-box、GARE-motif、TATC-box），茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、生长素响应元件（AuxRR-core、TGA-element）
以及水杨酸响应元件（TCA-element）（图4）。首先，在这5种类型的响应元件中，茉莉酸甲酯响应元件的数目最多，在所有激素功能响应元件中占有44个，脱落酸的数量次之含有43个。这暗示脱落酸和茉莉酸在龙眼的生长中起重要的作用;其次，这5种类型的响应元件在龙眼HD-Zip成员中的分布并不完全相同，其中DLHB2-1与DLHB4-9中包含5种激素响应元件;DLHB1-2、DLHB4-5、DLHB3-3、DLHB4-2包含4种激素响应元件，DLHB4-5对应的激素功能元件是脱落酸、水杨酸、生长素、茉莉酸甲酯响应元件，DLHB4-2与DLHB3-3对应的是脱落酸、赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯响应元件，DLHB1-2对应的是脱落酸、赤霉素、生长素、水杨酸响应元件;仅有DLHB3-2，Dlo-026005.1只包含了一种激素功能响应元件，分别为茉莉酸甲酯响应元件与脱落酸响应元件;其余的家族成员都包含了2～3种激素响应元件。在这些响应元件中生长素响应元件的数量虽仅含有8个，但却涉及4个亚家族的成员（DLHB1-2，DLHB2-1，DLHB3-3，DLHB4-1，DLHB4-2，DLHB4-5，DLHB4-9），这种情况提示了各个亚家族的成员在龙眼生长发育中既具有分工，又可能存在功能上的互补。由此可见龙眼HD-Zip基因家族成员参与了龙眼生长的激素响应调控。
2.2龙眼HD-Zip可变剪接分析
2.2.1 龙眼HD-Zip在不同组织部位的可变剪接分析 为进一步了解龙眼HD-Zip基因家族成员在不同组织部位中的可变剪接的发生状况。将龙眼不同组织部位（花、花蕾、叶、果皮、果肉、
根、种子、茎、幼果）的可变剪接情况做了统计，结果见图5。首先，从图中可以发现，在每一个组织器官中，内含子保留的可变剪接方式的发生次数都高于其余3种（外显子跳跃、3′端可变剪接、5′端可变剪接）可变剪接方式，可见内含子保留是龙眼HD-Zip基因家族成员在不同组织器官中的主要可变剪接方式;其次，其余3种可变剪接方式在不同组织部位的发生次数较为相近，其中在大部分的组织部位中外显子跳跃的发生次数都是最少的;再者，并不是每一个组织部位都包含4种可变剪接方式，其中，在花和幼果中均存在3种可变剪接方式，前者是外显子跳跃、3′端可变剪接、内含子保留，后者是3′端可变剪接、5′端可变剪接、内含子保留;在种子中只存在2种可变剪接方式（内含子保留、3′端可变剪接）。总的来说，龙眼HD-Zip基因家族成员在不同组织器官中，可变剪接方式不一，但主要以内含子保留方式为主。
2.2.2 龙眼HD-Zip在非胚性与胚性培养物中的可变剪接分析 在龙眼非胚性与胚性培养物中进行了龙眼HD-Zip的可变剪接情况预测，共检测出了160次可变剪接事件（图6）。结果表明，龙眼HD-Zip基因家族成员在不同体胚阶段的可变剪接方式与不同组织器官的可变剪接情况不同。首先，内含子保留剪接方式并不是在每一个阶段都存在的，在NEC、EC、ICpEC中内含子保留是主要的可变剪接方式，但在GE中却不存在这种剪接方式;其次，内含子保留方式只在ICpEC中显著高于其他3种可变剪接方式，再者，从图6中可以发现，在龙眼早期胚胎EC到GE阶段，内含子保留发生的次数呈现先下降再上升最后再下降的趋势且在ICpEC阶段达到了顶峰，暗示可变剪接在龙眼胚胎从EC到ICpEC的转变阶段中起到了重要的作用;5′端可变剪接的可变剪接发生次数呈现出了先减少后增多的现象，但变化趋势不是很明显;外显子跳跃以及与3′端可变剪接发生的次数呈现上升的趋势，但变化趋势同样不明显。总体来说，在不同体胚中，龙眼HD-Zip基因家族成员发生内含子保留的次数高于其他可变剪接发生次数，故龙眼HD-Zip基因家族成员在不同体胚阶段的可变剪接方式，主要还是以内含子保留为主。
2.3龙眼HD-Zip家族基因miRNA预测分析
采用在线软件psRNAtarget对龙眼HD-Zip基因家族的成员进行miRNA分析。第1次搜索将期望值设置为E=3.5，预测龙眼miRNA数据库中靶向调控HD-Zip家族成员的miRNA种类。共搜索出了5条结果，结果表明：19个龙眼HD-Zip家族成员有5个成员受到了miRNA的调控。其中龙眼HD-Zip家族主要受到miR166a的调控，并且调控的成员都是第Ⅲ亚家族的成员（DLHB3-1、DLHB3-2、DLHB3-3、DLHB3-4）。猜測miR166a通过调控HD-ZipⅢ，从而在植物的生长中起到重要的作用;此外该家族还受到了miR2118e的靶向调控（DLHB4-3）。
为了预测各亚家族的miRNA种类，第2次搜索将期望值设置为E=4.0。当E=4.0时，我们发现龙眼HD-Zip家族主要还受到miR444b的调控，且调控的家族成员都是第Ⅳ亚家族的成员（DLHB4-5、DLHB4-6）;提示miR444b可能在该亚家族中有着重要的调控作用;同时我们发现，DLHB2-1受到了miR417的靶向调控;DLHB1-3受到了miR437c的靶向调控（表2）。在E=4.0的条件下，各亚家族成员虽都受到miRNA的调控，但不难发现龙眼HD-Zip第Ⅲ、Ⅳ亚家族的成员受到miRNA的调控较多。总的来说，不同亚家族受到调控的miRNA种类不同，但同一亚家族成员受到的调控虽较为一致但也有差异，可能是HD-Zip家族的各亚家族成员之间的结构与功能特异性所致。
2.4在ABA处理下龙眼EC中HD-Zip的表达模式分析
由于在龙眼HD-Zip成员中广泛存在ABA响应元件，因此在龙眼HD-Zip各亚家族成员中随机选取了1条基因（DLHB1-3、DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-6）通过qPCR分析它们在ABA处理下龙眼EC中的表达模式。由图7可知，首先，在不同浓度的ABA处理之下，龙眼EC中4个HD-Zip成员呈现出了4种表达模式，其中DLHB1-3在50、500 μmol/L ABA处理下呈现上调表达，而在5000 μmol/L ABA处理下呈现下调表达;DLHB2-1在50、5000 μmol/L ABA处理下呈现上调表达，而在500 μmol/L ABA处理下呈现下调表达;DLHB3-3在500、5000 μmol/L ABA处理之下呈现上调表达，而在50 μmol/L ABA处理下呈现下调表达;DLHB4-6在50、500、5000 μmol/L ABA处理下均呈现上调表达;其次，值得关注的是，在50 μmol/L的ABA处理之下，DLHB1-3、DLHB2-1、DLHB4-6都呈现出了上调表达的趋势，且上调表达显著，暗示在该浓度ABA处理之下，这些成员在EC的形态建成中起到了重要的作用。
总的来说，在不同浓度的ABA处理之下，龙眼HD-Zip在EC中主要呈现出了上调表达的趋势，暗示该家族成员参与了ABA信号的传导，并且可能通过正向调节ABA的浓度，进而参与龙眼EC的形态建成。
2.5龙眼HD-Zip在龙眼不同体胚中的表达模式分析
为进一步了解龙眼HD-Zip在不同体胚中发育的机制，本实验随机挑选了4个家族成员（DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-1、DLHB4-5）在龙眼不同体胚阶段进行荧光定量分析。结果如图8所示：首先，在龙眼早期体胚的EC到GE发生阶段，4个家族成员呈现出了2种表达模式，在ICpEC与GE中都下调的基因有（DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5），并且下调表达显著;在ICpEC中下调而在GE中上调表达的基因为DLHB4-1，并且此基因在GE中上调表达显著;其次在NEC中，DLHB4-1上调表达显著，DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5下调表达显著。可见，龙眼HD-Zip家族成员在不同体胚阶段的表达模式呈现出共性以及互异性，提示在不同体胚的形态建成中，该家族成员的作用不尽相同。DLHB4-1在NEC与GE中上调表达显著，促进了NEC与GE的形态建成，DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5参与调控不同体胚的发育。总的来说，龙眼HD-Zip家族成员参与调控龙眼不同体胚的发育。
3 讨论
3.1龙眼HD-Zip的生物学功能具有多样性
本研究检测了4种类型的可变剪接方式（外显子跳跃、3ˊ端可变剪接、内含子保留、5ˊ端可变剪接），发现龙眼HD-Zip的可变剪接方式主要以内含子保留为主。且在本研究中发现在龙眼花、花蕾、果肉这些组织器官以及早期胚胎发育阶段的ICpEC时期，内含子保留的可变剪接发生事件均达到了较高值，猜测这种可变剪接方式可能参与了龙眼胚胎发生和果实成熟的重要过程。此前在草莓中就进行了受精前后的可变剪接事件对比，发现内含子保留率显著性下降，表明内含子保留参与了果实发育的过程[36];拟南芥中的AtBUD13基因通过影响pre-mRNA剪接，从而在早期胚胎发育中发挥着关键的作用，并且AtBUD13突变主要导致内含子的保留[27]。这一系列的研究表明，内含子保留方式的可变剪接在植物的生长与发育中非常重要，并为龙眼HD-Zip的内含子保留方式参与体胚发生过程以及果实发育提供了可能。
通过对龙眼HD-Zip家族进行调控miRNA预测，发现龙眼HD-Zip基因家族成员主要受到了miR166a和miR444b的调控，且前者受到调控的全部为第Ⅲ亚家族的成员（DLHB3-1、DLHB3-2、DLHB3-3、DLHB3-4）;后者受到靶向调控的全部为第Ⅳ亚家族的成员（DLHB4-5、DLHB4-6）。推测miR166a以及miR444b在龙眼HD-Zip家族中起到了重要的作用。据以往的研究报道可知，miRNA165和166能够切割它们的HD-ZipⅢ基因的靶mRNA，从而调节这些基因的功能[37]，与本研究中预测的HD-ZipⅢ主要受miR166a的调控的结果相符;miRNA166的前体以及成熟体参与龙眼早期阶段体胚的形态建成以及激素的响应[18]，推测miRNA166a可能也通过调控龙眼HD-Zip进而参与龙眼体胚的形态建成;miR444通过编码多种蛋白（如MADS），在玉米花的发育中起了重要的作用[38]，而HD-ZipⅣ恰好具有参与花发育的功能[10]，猜测龙眼HD-ZipⅣ成员通过受到miRNA444b的靶向调控，参与了花发育的过程。可见，龙眼HD-Zip可能通过参与miRNA的调控过程，进而参与激素的响应过程，体胚形态建成以及花的发育等多种植物生长发育过程。
总的来说，龙眼HD-Zip的AS方式以及受到miRNA的靶向调控，都为其生物学功能的多样性提供了可能，但AS以及miRNA對龙眼HD-Zip在胚胎中的调控机制，还需进一步深入的研究。
3.2龙眼HD-Zip可能参与ABA信号传导以及参与调控不同体胚的发育
根据对龙眼HD-Zip家族的启动子顺式作用元件中的激素响应元件进行分析，我们得知此家族成员中含有多种激素响应元件（脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、生长素响应元件以及水杨酸响应元件），由此猜测龙眼HD-Zip家族可能参与激素的响应过程。据此，本研究通过对不同浓度的ABA（0、50、500、5000 μmol/L）处理，对龙眼HD-Zip部分基因在EC中的表达模式进行分析，发现龙眼HD-Zip不同亚家族成员对ABA的响应程度不同，但在不同激素处理之下均出现了上调或者下调的表达，且主要以上调表达为主。据以往在水稻中的报道称，Oshox22（HD-ZipI）通过ABA介导的信号转导途径影响ABA生物合成[6]，可见HD-Zip家族成员确实参与了ABA的信号传导;同时ABA也在胚胎发育中又起着重要的作用[29]，由此推测龙眼HD-Zip可能参与ABA信号的传导，通过调节ABA的浓度进而影响胚性愈伤组织的生长发育以及形态的建成。同时为深入了解龙眼HD-Zip在龙眼胚胎发育中的机制，本研究通过对龙眼HD-Zip部分家族成员在不同体胚中的表达模式进行分析，发现不同成员呈现的表达模式不尽相同，其中DLHB2-1、DLHB3-3、DLHB4-5的表达模式较为一致，在NEC、ICpEC与GE中均表现出了下调表达，DLHB4-1在NEC与GE中显著表达。该结果提示龙眼HD-Zip家族成员参与调控体胚的发育，且部分成员可能在某些体胚的形态建成中起到了重要的促进作用。EgHOX1（HD-ZipII）在油棕的早期胚胎中呈现高表达[39];大多数HD-ZipⅣ基因在香蕉的体细胞胚中高度表达[40];拟南芥的REV、PHB、PHV首先于胚胎发育过程中的球形胚的顶端中部表达[41]，与龙眼HD-Zip成员在EC与ICpEC中就出现表达的情况不太一致，但同样参与体胚的发育过程。可见，HD-Zip与体胚的生长密切相关，也为龙眼HD-Zip参与调控不同体胚的发育提供了可能。
總之，龙眼HD-Zip可能既参与ABA的信号传导过程又参与调控不同体胚的发育。此前有研究报道，miRNA166的前体和成熟体在ABA处理之下在龙眼EC阶段呈现出了不同的表达模式[18]，结合本研究的miRNA预测，我们猜想龙眼HD-ZipⅢ成员在表达过程中可能与miRNA166a以及ABA构建了一个复杂的调控网络，进而参与EC的形态建成。总之，龙眼HD-Zip在胚胎发育中的作用，值得我们后续更加深入的分析。
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