龙眼体胚发生过程中RNA甲基化相关基因全基因组鉴定及表达分析

王静宇 陈晓慧 申序 徐小萍 张梓浩 林玉玲 赖钟雄

摘  要  為了解龙眼RNA甲基化相关基因的生物学功能，本研究基于基因组和转录组数据，采用生物信息学分析方法，进行龙眼基因组RNA甲基化相关基因成员鉴定，蛋白结构域及特性分析，分子进化树分析，体胚发生过程和组织器官基因表达水平分析以及ABA处理下的定量表达分析。结果显示：龙眼中有7个参与RNA甲基化过程中的关键基因，包括5个RNA甲基转移酶基因和2个去RNA甲基化酶基因;各成员内含子数量差别较大，为4～28个不等;进化树分析显示，龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白与甜橙亲缘关系最近;蛋白结构域分析显示，RNA甲基化相关酶具有保守的蛋白结构域;龙眼RNA甲基化相关基因启动子区域中主要含有光响应功能元件、激素响应功能元件、胁迫响应功能元件和分生组织表达响应元件，推测RNA甲基化相关基因可能对植物的生长发育和适应不良环境有一定调节作用;RNA甲基化相关基因部分成员在龙眼体胚不同发生阶段和不同组织器官中的表达有明显区别，推测龙眼RNA甲基化相关基因可能参与不同体胚发育阶段和组织器官形态建成;不同浓度ABA处理下，龙眼EC中RNA甲基化相关基因的表达情况各异，其中DlVIR、DlALKBH10B和DlMTB的相对表达量受到一定的抑制作用，而DlFIP37则呈现上调表达，暗示龙眼RNA甲基化相关基因参与激素响应途径。本研究表明，龙眼RNA甲基化相关基因除了可能在叶的形成、花的发育和植株的形态建成等方面发挥重要的作用外，还可能参与调控胚胎发育和响应非生物胁迫，推测龙眼RNA甲基化相关基因成员在功能上具有差异性和多样性。

关键词  龙眼;RNA甲基化相关基因;龙眼体胚发生早期;生物信息学分析;表达分析中图分类号  S667.2      文献标识码  A

Genome-wide Identification and Expression Analysis of RNA Methylation Related Genes During Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longanLour.

WANG Jingyu， CHEN Xiaohui， SHEN Xu， XU Xiaoping， ZHANG Zihao， LIN Yuling， LAI Zhongxiong^*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract  To understand the biological function of the longan RNA methylation related genes， based on the genome and transcriptome data， the RNA methylation related genes in longan genome were identified， the protein domains and characteristics， the molecular evolution tree， and the tissues and organs somatic embryogenesis gene expression level and the analysis of the quantitative expression of ABA treatment were analyzed using the bioinformatics analysis method. The results showed that seven key genes were involved in the RNA methylation， including five RNA methyltransferase genes and two RNA demethylase genes. The number of introns in each member varied greatly， ranging from 4 to 28. The result of evolutionary tree analysis showed that longon RNA methyltransferase and demethylase proteins were most closely related toCitrus sinensis.Protein domain analysis showed that RNA methylation related enzymes had conserved protein domain. The promoter region of RNA methylation related genes mainly contained light response elements， hormone response elements， stress response elements and meristem expression response elements. It is speculated that RNA methylation related genes may have a certain regulatory effect on plant growth and development and maladaptive environment. Some members of RNA methylation related genes showed significant differences in the expression of longan somatic embryo at different stages of development and in different tissues and organs. It was speculated that longan RNA methylation related genes might be involved in different somatic embryo development stages and tissue and organ morphogenesis. The expressions of RNA methylation related genes in longan EC were different under ABA treatment at different concentrations. The relative expression ofDlVIR， DlALKBH10BandDlMTBwas inhibited to some extent， whileDlFIP37showed up-regulated expression， suggesting that longan RNA methylation related genes were involved in the hormone response pathway. In this study， longan RNA methylation related genes may play an important role in leaf formation， flower development and plant morphogenesis， and may also be involved in regulating embryo development and responding to abiotic stress. It is speculated that longan RNA methylation related genes had differences and diversity in function.

Keywords  longan; RNA methylation related genes; early stage of somatic embryogenesis; bioinformatic analysis;  expression analysis

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.003

近年来，RNA修饰作为转录后水平的一类调控方式，由其参与调节的一系列RNA代谢过程对细胞的分裂和分化等过程有重要影响，受到了广泛的关注，并在表观遗传领域被列为研究重点之一^[1]。RNA修饰存在多种类型，事实上，细胞中的每一类RNA分子都可以被转录后修饰，而且某些修饰在进化上是保守的，可能是翻译所不可缺少的，甲基化修饰则是RNA修饰的主要形式之一。在各种RNA甲基化修饰类型中，m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是mRNA中最丰富也是最常见的一种甲基化修饰^[2]，普遍存在于哺乳动物、植物、细菌和病毒等多个物种中，在调控mRNA的代谢和加工过程中发挥着广泛的作用^[3]。m6A虽早在19世纪70年代就被鉴定存在于RNA上，但其详细的生物学功能仍是未知，随着抗体富集和测序技术的发展，转录组水平m6A分布图谱得以精确绘制，进而发现m6A具有保守修饰基序RRACH（R代表A或G，H代表A、U或C），并分布于3'非翻译区、外显子和终止密码子附近^[4]。m6A的甲基化是由3个关键亚基组成的多蛋白“writer”复合物完成的：“编码器”RNA甲基转移酶（如METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429）、“消码器”RNA去甲基化酶（如ALKBH5）和“读码器”RNA甲基化修饰结合蛋白（如m6A结合蛋白YTHDC1）分别介导RNA甲基化的修饰过程、RNA去甲基化修饰过程和下游RNA的翻译、降解等过程^[5-8]，所以m6A修饰是一种可逆的过程，它在由编码器发挥作用的同时也可以被消码器轻易地擦除^[9]，m6A还可以作为影响蛋白-RNA相互作用的RNA结构开关^[10]，参与并调节生物体的一些重要的生物学过程。研究发现，m6A能够影响造血干细胞、精细胞、癌细胞、神经细胞和免疫细胞的发育，进而影响它们的稳态和功能^[11]。

目前关于植物中m6A甲基化知识有限，但通过对拟南芥2个不同品种的转录组数据测序发现，m6A在植物中对mRNA具有高度保守性和动态修饰性^[12]，这种保守性也促进了我们对m6A修饰途径的研究和理解。拟南芥中已经鉴定了几种参与m6A修饰的RNA甲基转移化酶：分别是MTA70（METTL3的植物同源基因）、MTB（METTL14的植物同源基因）、FIP37（WTAP的同源基因）、VIR（KIAA1429的同源基因）和E3泛素連接蛋白HAKAI以及由ALKBH5编码的RNA去甲基化酶ALKBH10B和ALKBH9B^[13]。它们具有调节植物细胞的昼夜节律，影响干细胞功能的多样性和调节植物开花等功能^[14]，揭示了m6A修饰功能上的重要性。目前虽然关于植物中m6A甲基化的研究只在拟南芥和一些哺乳动物的RNA甲基化研究中有所涉及，而关于其他高等植物m6A修饰作用的机制鲜有报道，尤其在无患子科龙眼中尚未涉及此方面的研究。

龙眼是我国著名的无患子科亚热带木本植物，其体胚发生情况与其生长状况、营养水平、产量情况密切相联^[15]，而体胚的生长发育不仅受外界环境影响，还与植物本身遗传特性、基因的表达和调控有关。脱落酸（ABA）是调控植物生长发育的主要激素之一，它在高等植物营养生长的环境胁迫反应中起着重要作用，特别是对植物体胚发生有多方面的影响。有研究发现，ABA能够促进云南大叶茶和杂交落叶松等多种植物体胚成熟^[16]，且ABA对体胚的调控作用与其浓度和体胚发生阶段均有关联，其介导的反应之一是诱导基因的表达^[17]，于是采用荧光定量PCR分析不同浓度ABA处理下，龙眼胚性愈伤组织中（EC）RNA甲基化相关基因的表达情况，推测各基因成员在EC发育过程中所执行的功能。此外，龙眼基因组数据的释放，为龙眼体胚发生过程中RNA甲基化相关基因全基因组鉴定提供了良好的数据平台。因此，本研究通过对龙眼RNA甲基化相关基因成员进行系统命名，对其基因结构、蛋白质特性、蛋白保守结构域、系统进化树、启动子中顺式作用元件进行分析，以及各基因成员在不同体胚发生阶段和组织器官特异表达FPKM分析，了解龙眼RNA甲基化相关基因成员可能存在的生物学功能，为进一步了解龙眼体胚发生过程的分子机制提供依据，也为研究RNA甲基化相关基因对植物生长发育的影响提供理论依据。

1  材料与方法

1.1材料

由本实验室构建的龙眼基因组数据库（NCBI登录号：BioProject PRJNA305337）、龙眼转录组数据库（SRA050205）;龙眼、拟南芥、水稻、甜橙RNA甲基化酶基因家族等相关序列信息。以福建农林大学园艺植物生物工程研究所诱导并继代培养的龙眼LC胚性愈伤组织（EC）为材料，非胚性愈伤组织（NEC）、胚性愈伤组织（EC）、不完全胚性紧实结构（ICpEC）和球形胚（GE）则参照赖钟雄^[18]建立的方法获得。

挑选培养了20 d的生长发育较好的龙眼愈伤组织作为材料，进行不同浓度的脱落酸（ABA）处理：取5个200 mL锥形瓶，洁净干燥后各加入50 mL的MS液体培养基，之后分别加入不同浓度（0、5 、50、500、5000 μmol/L）的ABA。接着将选取好的龙眼愈伤组织接种于培养基中，置于25 ℃、110 r/min的摇床中，黑暗培养24 h。最后收集处理后的材料进行荧光定量分析^[19]。

1.2方法

1.2.1  RNA甲基化相关基因的鉴定与进化树构建  以拟南芥TAIR-Home Page（https：//www. arabidopsis.org/）下载的RNA甲基转移酶和去甲基化酶氨基酸序列为种子序列，经与龙眼基因组数据库同源比对，筛选获得7条具有完整Open Reading Frame（ORF）的龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶候选序列。根据基因组注释，采用DNAMAN 6.0软件对RNA甲基化相关酶的gDNA、CDS以及启动子序列进行比对分析，结合NCBI Blast同源比对分析，初步确定龙眼RNA甲基化相关基因成员。再采用Conserved Domains Database（CDD）分析候选序列的蛋白结构域，采用phmmer search HMMER v 3.0软件对候选序列蛋白结构域进一步分析;通过DNAMAN 6.0软件一致性比对，根据拟南芥RNA甲基化相关基因成员在龙眼基因组中的查找注释，参考拟南芥RNA甲基化相关基因命名方法，对龙眼RNA甲基化相关基因成员进行鉴定和命名。

利用水稻基因组RAP-DB-Keyword Search（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/search/run），甜橙基因组Orange Genome Annotation Project（http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/）网站下载到相应的RNA甲基化相关酶的氨基酸序列，采用MEGA 6.06软件中的邻接法（Neighbor-joining method），自展法系数（Bootstrap）设置1000次重复检验。对龙眼、拟南芥、水稻、甜橙4个物种的28条RNA甲基转移酶和去甲基化酶成員氨基酸序列进行系统进化树构建。

1.2.2  龙眼RNA甲基化相关基因结构及蛋白结构域分析  采用TBtools对龙眼7条基因成员进行基因结构的内含子、外显子特征分析;采用ExPASy对7条RNA甲基化相关酶氨基酸序列进行蛋白的等电点（pI）、分子量（Mw）、氨基酸数目（aa）及亲水性分析;采用 Net Phos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测磷酸化位点;通过MEME（multiple expectation maximization for motif elicitation）圣地亚哥超级计算机中心（SDSC）开发的一套用来寻找一组相关的DNA序列或者蛋白质序列的基序（motif）的程序在线分析龙眼RNA甲基化相关基因的保守motif;采用TBtools^[20]对获得的motif进行绘制。为分析RNA甲基化相关基因成员的基因结构特征，整理出这4个物种的domain信息和domain长度，再用TBtools构建蛋白结构域，进一步了解RNA甲基化相关基因的生物学功能。

1.2.3  龙眼RNA甲基化相关基因启动子分析  从龙眼全基因组数据库（http：//gigadb.org/？ tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）中提取的每个龙眼RNA甲基化相关基因起始密码子上游2000 bp基因组序列搜索植物启动子顺式作用元件，采用在线数据PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）预测顺式作用元件^[21]。

1.2.4  RNA甲基化相关基因成员在龙眼体胚不同发育阶段和不同组织器官特异表达分析  为进一步了解各成员在龙眼体细胞胚胎和不同组织器官中可能发挥的功能特点，结合龙眼基因组数据库提取的RNA甲基化相关基因在龙眼体胚发生的NEC、EC、ICpEC、GE各阶段和不同组织器官（种子、根、茎、叶、花、花蕾、果肉、幼果、果皮）中特异表达的FPKM值，分析RNA甲基化酶基因各成员的相对表达情况。

1.2.5  龙眼RNA甲基化相关基因成员在不同激素处理下的特异性表达  利用从龙眼转录组数据库中提取RNA甲基化相关基因成员在不同激素（2，4-D、2，4-D-KT、KT和MS）中特异表达的FPKM值，再通过TBtools构建聚类分析图以了解龙眼RNA甲基转移酶基因成员在不同激素中的差异性表达。

1.2.6  龙眼RNA甲基化相关基因成员qPCR引物设计和分析  利用DlHAKAI、DlMTA70、DlMTB、DlFIP37、DlVIR、DlALKBH10B和DlALKBH9B 7条龙眼RNA甲基化相关基因成员的CDS序列通过Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）初步设计正向和反向引物，再通过Beacon Designer Free Edition（http：//www.premierbiosoft.com）进行筛选，得到以下符合引物设计原则的引物（表1）。再以Fe-SOD、elF-4a和elF-4a为内参基因^[22]，根据内参基因的FPKM值计算出RNA甲基化相关基因成员的相对表达量，并用Excel软件进行数据处理和统计分析。

2  结果与分析

2.1龙眼RNA甲基化相关基因的鉴定

参考拟南芥RNA甲基化相关酶氨基酸序列，利用TBtools对龙眼基因组数据进行同源比对，筛选得到了7个RNA甲基化途径中关键的基因。对获得的RNA甲基化相关基因经NCBI Blast比对，参考拟南芥RNA甲基化相关基因成员命名方法，将其命名为DlMTA70、DlMTB、DlVIR、DlHAKAI、DlFIP37、DlALKBH9B和DlALKBH10B（表2）。

2.2龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白质特性分析

通过对蛋白质特性分析发现（表3），龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶的氨基酸长度在374～2309 aa之间，蛋白分子量在42722.46～ 252444.78 u之间，等电点（pI）在5.20～8.25之间。采用NetPhos 3.1 Server对龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白进行磷酸化位点预测，结果显示：DlALKBH10B蛋白含有67个磷酸化位点（Ser：43 Thr：20 Tyr：4），DlALKBH9B蛋白含有61个磷酸化位点（Ser：39 Thr：15 Tyr：7），DlFIP37蛋白含有31个磷酸化位点（Ser：17 Thr：13 Tyr：1），DlHAKAI蛋白含有28个磷酸化位点（Ser：23 Thr：4 Tyr：1），DlMTA70蛋白含有70个磷酸化位点（Ser：39 Thr：25 Tyr：6），DlMTB蛋白含有174个磷酸化位点（Ser：117 Thr：35 Tyr：22），DlVIR蛋白含有含有254个磷酸化位点（Ser：191 Thr：48 Tyr：15），可见RNA甲基转移酶和去甲基化酶不同成员可能存在功能差异。

2.3植物RNA甲基转移酶和去甲基化酶成员的系统进化树分析

为进一步了解RNA甲基转移酶和去甲基化酶的生物学功能，采用MEGA 6.06软件构建拟南芥、龙眼、水稻和甜橙的RNA甲基转移酶和去甲基化酶氨基酸序列系统进化树（图1）。结果发现，28条序列分为3个大支，与拟南芥中的RNA甲基化相关酶蛋白分支结构相同，FIP37、MTA70和MTB为1个分支，HAKAI、VIR为一个分支，ALKBH9B和ALKBH10B为一个分支，其中FIP37、MTB和MTA70这个大分支又被分为2个独立的分支，MTA70、MTB为一分支，FIP37单独为一分支。拟南芥中RNA甲基化相关酶蛋白的这种分类与甜橙相同。龙眼RNA甲基转移酶HAKAI属于拟南芥中的HAKAI、VIR分支，甜橙的HAKAI分支;龙眼RNA甲基转移酶VIR属于拟南芥中的VIR、HAKAI分支，甜橙中的VIR分支;龙眼RNA甲基转移酶MTA70属于拟南芥的MTA70、MTB分支，甜橙的MTB分支;龙眼RNA甲基转移酶MTB属于拟南芥的MTA70、MTB分支，甜橙的MTA70分支;龙眼RNA去甲基化酶ALKBH10B属于拟南芥ALKBH10B、ALKBH9B分支，甜橙的ALKBH10B分支;龙眼RNA去甲基化酶ALKBH9B属于甜橙的ALKBH9B分支;龙眼RNA甲基转移酶FIP37属于拟南芥的FIP37分支。其中龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白与甜橙的亲缘关系最近。

2.4龙眼RNA甲基化相关基因结构分析

为分析RNA甲基化相关基因的结构特征，进一步了解龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶的生物学功能，对龙眼7条基因的结构进行内含子、外显子数目及位置进行分析（图2）。结果显示，所有龙眼RNA甲基化相关基因中第1个内含子均位于成熟编码序列内部，可将信号序列和编码序列明显地区别开来。最值得注意的是DlALKBH10B成员含有外显子的非蛋白质编码部分。这7个RNA甲基化相关基因成员内含子数为4～28个，其中最多的是龙眼DlVIR基因，有28个内含子，其次是DlALKBH9B基因，有14個内含子。RNA甲基化相关基因成员外显子数目为3～30个。有3个成员的内含子和外显子的数目相同，同一分枝的RNA甲基化相关基因内含子、外显子位置分布和数量有相似的地方，但相似程度较小。另外这7个基因长度也有显著差异，长度在500～30000 bp，其中最短的是DlHAKAI，最长的是DlVIR，为30 000 bp左右，不同分支的RNA甲基化相关基因外显子-内含子结构数量分布差异明显，这可能与其基因功能的分化有关。

2.5龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶蛋白

结构域分析

为了解龙眼RNA甲基化相关基因在龙眼中的蛋白保守结构域特点与分布情况，通过MEME软件，搜索出10个motif（图3）。分析结果显示，这7条序列中大多数包含motif 8和motif 10这2个motif，表明这2个基序在龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶中较为保守，其中最保守的是motif 10，其中有5个成员都包含该基序。从龙眼RNA甲基化相关酶的保守基序分散程度可知，大多数成员的基序比较聚集，除了DlALKBH10B的首个motif离其他2个motif较远，DlVIR的3个motif位置很分散，DlALKBH10B、DlFIP37和DlVIR这3个成员的motif数量较少，且位置较其他成员分散。

保守结构域结果分析（图4）显示，龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶成员所含有的蛋白结构域种类和数量各异，其中最值得注意的是DlALKBH9B含有最多的结构功能域，包括2个ZnF_RBZ、1个zf-RanBP和1个DlALKBH10B同样具有的2OG-FeII_Oxy结构域，由此可见，在进化树中位于同一分支的部分成员具有相同的蛋白结构域，推测它们可能具有相似的生物学功能。结合拟南芥、水稻和甜橙的氨基酸序列预测的结构域分析发现，大多数成员都含有MT-A70结构域，拟南芥AtVIR只含有唯一1个VIR_N结构域，甜橙中的CsVIR成员只含有唯一1个Activator_LAG-3结构域。且经过分析得出龙眼、水稻和甜橙3个物种的HAKAI的首个结构域均为RING-HC_HAKAI_like，推测该类型蛋白成员具有保守的结构域。

2.6龙眼RNA甲基化相关基因的启动子分析

为深入了解龙眼RNA甲基化相关基因不同成员启动子的功能差异，对RNA甲基化相关基因上游2 000 bp的启动子序列进行顺式作用元件预测（图5）。结果显示，龙眼RNA甲基化相关基因（DlMTA70成员无完整的启动子，不予分析）的启动子区域中含有大量核心启动子元件如TATA-box和CAAT-box外，富含多个不同类型的光响应元件，除此之外还含有植物激素应答元件和逆境响应元件。所有基因成员启动子区域含有的植物激素响应元件包括生长素响应元件（TGA-element）、水杨酸响应元件（TCA element）、茉莉酸响应元件（CGTCA-motif）、赤霉素响应元件（GARE-motif）和脱落酸响应元件（ABRE）。除了DlALKBH9B外，其他所有成员启动子区域都含有2种植物激素响应元件。每个成员都预测到参与逆境响应的功能与元件，包括厌氧诱导响应元件（ARE）、诱导子激活元件（AT-rich element）、防御和逆境响应元件（TC-rich repeats）、低温响应元件（LTR）和干旱胁迫响应元件（MBS），但这些元件数量较少，例如DlFIP37成员启动子区域只含有1个防御和逆境响应元件，因此我们只能判断RNA甲基化相关基因参与逆境响应，但不能确定它们对植物生长过程中适应逆境是必要的。此外，DlALKBH9B和DlHAKAI成员各含有1个玉米醇溶蛋白代谢调控元件（O2-site），表明它们参与玉米醇溶蛋白的代谢过程，发挥决定玉米蛋白营养特性的作用^[23]。DlHAKAI、DlMTA70和DlFIP37含有分生组织表达响应元件，推测这3个成员参与调控龙眼的分生组织的分化过程。其中DlALKBH9B含有唯一1个胚乳表达负调控元件（AACA_motif），表明该成员参与龙眼的胚乳发育调控，影响种子的成熟。除了以上所述功能元件外，这6个成员的启动子区域还含有一些未命名的、功能未知的顺式作用元件。通过对龙眼RNA甲基化相关基因成员的启动子分析，可以了解到RNA甲基化相关基因参与调控植物的生长发育和抵抗逆境胁迫过程。

2.7龙眼体胚发生过程中RNA甲基化相关基因表达分析

对RNA甲基化相关基因在龙眼早期胚胎的FPKM进行分析发现，RNA甲基化途径中关键的基因在NEC阶段表达量均较低，在体胚发生早期有较高的表达丰度（图6）。其中VIR、MTB和FIP37在体胚发生早期阶段中表达了逐渐上调。ALKBH9B在EC阶段表达量最高;MTA、HAKAI和ALKBH10B则在ICpEC阶段有最高的表达量。此外，RNA甲基化修饰基因HAKAI和RNA去甲基化基因ALKBH10B较其他基因在体胚发生早期中的表达量最高，提示体胚发生早期可能存在m6A形式的RNA甲基化和去甲基化事件。

2.8龙眼不同组织部位中RNA甲基化相关基因表达分析

对RNA甲基化相关基因在根、茎、叶、花、花芽、种子、果肉和果皮等不同组织部位中的表达分析显示，龙眼RNA甲基修饰关键基因在不同组织部位中广泛表达（图7）。VIR、HAKAI和ALKBH9B在果肉中表達最高;MTA、MTB和FIP37在叶片中表达量最高;ALKBH10B在花中表达量最高，提示龙眼RNA甲基修饰关键基因对龙眼不同组织部位的生命活动具有重要作用。这些成员在种子、果皮和根中均下调，除了HAKAI和FIP37在果皮和根微上调外，只有2个成员（VIR、HAKAI）在幼果中下调，其余成员均上调，但它们和ALKBH9B在果肉中都显著上调，总之这些基因成员在种子、果皮、根、茎、花和花蕾中大部分均下调表达。由此可见，RNA甲基化相关修饰基因成员在龙眼早期胚胎发育的各个阶段中表达程度不同，主要在非胚性阶段表达水平较高，在胚性阶段表达水平较低，推测各成员对龙眼的各个组织和器官及体胚阶段的发育有差异性，具有重要的调节作用。

2.9龙眼RNA甲基化相关基因成员在不同激素下的表达模式分析

对龙眼RNA甲基化相关基因成员在不用激素下的表达模式分析显示，只有DlHAKAI和DlALKBH10B2个成员在4种激素的处理下呈上调表达，其他成员均呈下调表达（图8）。推测这4种激素可能促进DlHAKAI和DlALKBH10B的表达，但对其他成员的表达起抑制作用。

采用qPCR方法研究不同浓度ABA处理下龙眼EC中RNA甲基化相关基因的特异性表达，分析结果（图9）显示，随着ABA浓度升高，DlHAKAI的表达量呈现先下降后上升再下降的趋势，在低浓度（5和50 μmol/L）处理下呈下调表达，在高浓度500 μmol/L处理下呈上调表达;与对照相比，不同浓度ABA处理对DlMTA70的表达无显著差异，推测ABA可能对DlMTA70的表达无明显影响;此外，不同浓度ABA处理的DlFIP37表达量均明显高于对照，特别是在ABA浓度为5 μmol/L处理下DlFIP37的表达量最高，推测ABA可促进DlFIP37的表达;整体来看，随着ABA浓度升高，DlALKBH9B的表达量呈上升趋势，图中显示ABA浓度为500 μmol/L时达到最大，但并不能确定是DlALKBH9B在龙眼EC中最大表达的ABA浓度，我们可以在500～5000 μmol/L之间设置浓度梯度来研究其最适表达的ABA浓度。此外，在不同浓度ABA处理后的龙眼EC中，DlVIR和DlALKBH10B的表达模式几乎一致，这2个成员的表达量均发生显著变化，但都低于对照水平，可能与ABA影响龙眼体胚内源激素的调节有关。与对照相比，在5 μmol/L ABA处理后的龙眼EC中DlMTB的表达量小幅度上调，但在其他浓度的ABA处理后DlMTB表达量均低于对照。以上结果分析发现，ABA能够通过诱导基因的表达发挥作用^[24]，而不同浓度ABA处理对各基因的表达量影响也各不相同，同时验证了其生理作用不表现为两重性^[25]。

3  讨论

3.1龙眼RNA甲基化相关基因成员可能在功能上具有多样性

已有研究大多是关于拟南芥和部分哺乳动物RNA甲基化相关酶的基因组分析，而关于其他高等植物在此方面的研究则鲜有报道，且尚未见无患子科植物的RNA甲基化相关酶基因组分析报道。在龙眼基因组中筛选出7个RNA甲基化途径中的关键酶，采用类似的方法，在甜橙和水稻基因组中分别鉴定出7个RNA甲基化过程中关键酶。通过对龙眼、甜橙、水稻和拟南芥4个物种的有关酶的氨基酸序列构建的进化树分析发现，龙眼的RNA甲基化相关酶在进化上与甜橙相似。再结合蛋白结构域分析，DlALKBH10B除含有2OG-FeII_Oxy结构域外，还含有1个GGN结构域;DlVIR除含有VIR_N结构域外，还含有1个Creb_binding结构域，与其他3个物种比较，发现这2个结构域为龙眼RNA甲基转移酶和去甲基化酶所特有，体现了RNA甲基化相关酶的物种特异性。对龙眼RNA甲基化相关基因启动子序列顺式作用元件分析发现，DlMTA70、DlHAKAI和DlFIP37中均含有分生组织表达相关顺式作用调控元件，结合RNA甲基化相关基因在龙眼不同组织器官中的特异表达分析发现，DlFIP37在花芽和花中表达量较低，而在龙眼随后生长阶段的幼果中表达量较高，暗示DlFIP37介导龙眼关键芽分生组织基因转录本的m6A甲基化过程，并推测DlFIP37对芽干细胞的增殖分化有所影响，能够防止分生组织的異常增殖^[26]。在拟南芥中关于m6A修饰研究显示ALKBH10B是一种RNA去甲基化酶，能够在体外和体内逆转m6A在mRNA中的修饰，其表达能够降低poly（A）⁺RNA中的m6A的总水平，促进植物开花，并使植物呈现早花表型。总之m6A在拟南芥中能够调控开花时间，主要是ALKBH10B介导的m6A去甲基化酶通过影响关键开花时间调控因子的mRNA的稳定性，从而影响花的发育^[27]。图7显示ALKBH10B在龙眼的花中表达量较高，可推测其能够促进营养生长以使龙眼提前开花。Batista等^[28]报道ALKBH9B可以在体外去除m6A，其去甲基化活性通过ALKBH9B与紫花苜蓿花叶病毒的外壳蛋白相互作用调控紫花苜蓿花叶病毒的感染。m6A已被发现在花的转化中发挥表观遗传学调控作用，但其是否影响开花时间尚不清楚。总之，准确的开花时间对确保植物正常的繁殖至关重要，这些发现也有利于对RNA甲基化酶的作用机制开展更深层次的研究。

3.2龙眼RNA甲基化相关基因可能参与调控体胚发育进程

目前有关RNA甲基化相关基因对植物体胚发生过程的调控作用的报道仍较少，但已有报道称MTA70基因的缺失会导致胚胎死亡或胚胎发育被抑制在球状胚或心形胚阶段，且FIP37在拟南芥中被首次确定与MTA70协同作用，由于胚乳和胚胎发育的延迟，FIP37的敲除会导致胚胎死亡^[29]。关于KIAA1429的敲除对小鼠胚胎发育影响的研究通过胚胎移植观察不同时期的孕鼠胚胎，发现胚胎在移植几天后发生阻滞和死亡，最终结果表明KIAA1429是一个参与胚胎发育的关键基因^[30]。研究发现ABA并不能促进龙眼体胚的发生，Akula等^[31]认为，单独使用ABA会抑制体胚的发育。结合不同浓度ABA处理下龙眼EC中RNA甲基化相关基因的表达模式分析，DlMTA70和DlFIP37均呈现上调表达，而DlVIR的表达量则被抑制，故只能推测RNA甲基化相关基因在调控体胚发生过程中扮演了重要的角色，各成员影响体胚发育的机制仍不明确，需要进一步研究。

3.3 RNA甲基化相关基因可能响应激素应答和非生物胁迫反应

随着m6A研究的兴起，RNA甲基化相关基因对植物的激素应答和响应逆境胁迫也逐渐引起人们的重视。通过对具有完整启动子的6个参与龙眼RNA甲基化关键酶基因成员的顺式作用元件分析发现，DlALKBH9B成员启动子区域只含有大量光响应功能元件和厌氧诱导响应元件，几乎没有植物激素应答元件。但结合这7个成员在龙眼早期胚胎和组织器官的FPKM分析发现，该成员参与调控植物体胚和各组织器官的发育。其他成员的启动子区域至少含有2个激素响应功能元件，大多成员具有茉莉酸甲酯应答元件，茉莉酸甲酯能够促进植物幼茎和叶片生长并提高ABA含量，而ABA又能提高植物的抗旱性^[32]。此外，RNA甲基化相关基因成员启动子区域还具有脱落酸、生长素和赤霉素等多种激素应答元件，推测RNA甲基化相关基因成员参与多种植物激素应答通路。各基因成员中上游启动子区含有干旱胁迫响应元件、厌氧诱导响应元件、防御和逆境响应元件和低温响应元件等非生物胁迫响应元件，推测在逆境中转录因子与RNA甲基化相关胁迫应答基因启动子的顺式作用元件结合，特异性地启动应答基因的转录表达，从而对非生物胁迫做出调节反应^[33]。此外，龙眼EC在经过不同浓度ABA处理后，RNA甲基化相关基因表达情况各异，这些结果都表明RNA甲基化酶参与调控植物生长发育和逆境胁迫，但各类响应元件数量较少，且分子作用机制例如龙眼RNA甲基化酶如何感受和传递外界不良环境的刺激以调控龙眼的生理机能还尚不明确，我们可以通过继续研究其他物种如拟南芥和甜橙等含有与龙眼相同RNA甲基化酶基因的功能和作用机制作为参考。总之，未来的研究应该探索m6A调控植物生长发育更深层、更详细的机制。

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