p16基因与BAP1蛋白表达缺失在腹膜恶性间皮瘤诊断和鉴别诊断中的作用

高志斌 王兆平 徐瑛 傅家欣

[摘要] 目的 探讨p16基因及BRCA相关蛋白1（BAP1）表达缺失在腹膜恶性间皮瘤（PMM）病理诊断和鉴别诊断中的应用价值。 方法 选取我院2010年1月～2018年12月确诊为PMM的40例以及各30例卵巢浆液性癌和反应性间皮细胞增生病例作为研究对象。采用荧光原位杂交（FISH）方法检测p16基因在PMM和反应性间皮细胞增生中表达缺失，以及免疫组织化学方法检测BAP1在PMM、卵巢浆液性癌及反应性间皮细胞增生中的表达缺失，分析两者在PMM病理诊断和鉴别诊断中的作用。 结果 PMM标本中p16基因表达缺失率為45%，反应性间皮细胞增生标本中缺失率为0。PMM标本中p16基因表达缺失率高于反应性间皮细胞增生，差异有统计学意义（P<0.01）。BAP1在PMM、卵巢浆液性癌、反应性间皮细胞增生标本中的表达缺失率分别为65%、0和0，BAP1在PMM与卵巢浆液性癌和反应性间皮细胞增生的表达缺失率差异有统计学意义（均P<0.01）。 结论 p16基因表达缺失在诊断和鉴别诊断PMM时有明确的诊断价值。BAP1在PMM与反应性间皮细胞增生和卵巢浆液性癌进行鉴别诊断时，也有确切的诊断价值，可作为又一项重要的免疫组化诊断指标。

[关键词] 腹膜恶性间皮瘤;卵巢浆液性癌;反应性间皮细胞增生;免疫组织化学;p16;BAP1

[中图分类号] R735.5          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）27-0131-04

[Abstract] Objective To investigate the value of p16 gene and BRCA-related protein 1（BAP1） expression loss in the pathological diagnosis and differential diagnosis of peritoneal malignant mesothelioma（PMM）. Methods 40 patients with PMM diagnosed in January 2010 and December 2018， and 30 cases of ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell hyperplasia were selected as subjects. Fluorescence in situ hybridization（FISH） was used to detect the loss of expression of p16 gene in PMM and reactive mesothelial cell proliferation， and immunohistochemistry was used to detect the expression loss of BAP1 in PMM， ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell proliferation. The role of both in the pathological diagnosis and differential diagnosis of PMM was analyzed. Results The loss rate of p16 gene expression in PMM specimens was 45%， and the loss rate in reactive mesothelioma specimens was 0. The loss rate of p16 gene expression in PMM specimens was higher than that in reactive mesothelial cells， and there was significant difference（P<0.01）. The expression loss rate of BAP1 in PMM， ovarian serous carcinoma， and reactive mesothelial cell proliferation specimens was 65%， 0 and 0， respectively. There were significant statistical differences in the expression loss rate of BAP1 between PMM and ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell proliferation（all P<0.01）. Conclusion The loss of p16 gene expression has a clear diagnostic value in the diagnosis and differential diagnosis of PMM. BAP1 has a definite diagnostic value in the differential diagnosis of PMM with reactive mesothelial cell proliferation and ovarian serous carcinoma， and can be used as another important immunohistochemical diagnostic index.

[Key words] Peritoneal malignant mesothelioma; Ovarian serous carcinoma; Reactive mesothelial cell proliferation; Immunohistochemistry; p16; BAP1

腹膜恶性间皮瘤（peritoneal malignant mesothelioma，PMM）是指来自腹膜间皮细胞的原发性高度恶性肿瘤，在病理组织形态学上分为上皮型、肉瘤型和混合型，其中上皮型最为常见，而上皮型PMM与同在盆腔的卵巢浆液性癌以及腹膜反应性间皮细胞增生组织形态学上有相似之处，鉴别诊断困难。PMM的诊断通常需要结合病史、临床资料、腹水肿瘤标志物、影像学资料，以及病理组织学形态、免疫组织化学和分子生物学检测等方法进行综合判断才能确诊。即使已有多样的辅助诊断方法，PMM的诊断至今仍然比较困难[1-2]。近年来有关p16基因和BAP1蛋白表达缺失在PMM中的研究，国外报道相对较多，国内报道很少。本文收集40例PMM病例，结合有关文献进行探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料

收集本院2010年1月～2018年12月临床病理确诊为PMM的病例共40例，全部为女性，年龄44～72岁，中位年龄56岁，其中30例有20～40年手纺石棉史，标本均为肿瘤切除术大标本。其中上皮型32例，双相型8例。40例病例中有19例术前即被初诊为PMM，其他被初诊为卵巢癌12例，盆腔恶性肿瘤9例。选取同期30例卵巢浆液性癌（年龄48～76岁，中位年龄58岁）根治术大标本以及30例反应性间皮细胞增生病例标本作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 组织学  组织标本采用中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片以及HE染色，全部PMM、卵巢浆液性癌以及反应性间皮细胞增生病例病理诊断均由两位以上的高级职称医师进行复核，PMM病理诊断严格参照文献中要求的诊断标准[3-4]。

1.2.2 免疫组织化学染色  组织标本进行免疫组化EnVision染色，采用微波抗原热修复法，DAB显色。所用多克隆BAP1一抗（浓缩型）为abcam公司产品，二抗试剂盒为福建迈新生物科技有限公司产品。

1.2.3 FISH检测  按照说明书进行样本准备与变性、探针混合物准备与变性、玻片洗涤、结果观察等。实验采用北京金菩嘉医疗科技有限公司的第17号染色体着丝粒探针/第9号染色体p16基因位点特异性探针。GLP p16由四甲基罗丹明标记，在荧光显微镜下呈红色信号。CSP17由细胞绿进行标记，在荧光显微镜下呈绿色信号。结果判定：正常细胞均表现为二倍体，细胞核内分别可见2个红色和2个绿色信号。p16基因缺失表现为每个细胞核内只出现2个信号。每一例计数至少100个不重叠的细胞核，≥10%的肿瘤细胞胞核红色纯合丢失并至少有1个绿色信号被判断为阳性[5，6]。

1.3 统计学方法

应用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH检测PMM和反应性间皮细胞增生标本中p16基因缺失的情况

40例PMM标本中，18例（45%）发生p16基因缺失。30例反应性间皮细胞增生标本中均未检测出p16基因缺失。PMM标本中p16基因缺失率高于反应性间皮细胞增生，差异有统计学意义（χ2=18.173，P<0.01）（封三图3、4）。

2.2 免疫组化检测PMM、反应性间皮细胞增生和卵巢浆液性癌标本中BAP1蛋白的表达缺失情况

BAP1可同时表达于细胞核和细胞浆，主要以细胞核为阳性表达部位，阳性表达为出现黄色或棕色颗粒。40例PMM中26例阴性表达，BAP1基因表达缺失率为65%（封三图3）。30例卵巢浆液性癌均呈阳性表达，BAP1基因表达缺失率为0，BAP1在PMM与卵巢浆液性癌的表达缺失率差异有统计学意义（χ2=31.023，P<0.01）。30例间皮细胞反应性增生也均呈阳性表达，BAP1基因表达缺失率也为0，BAP1在PMM与间皮细胞反应性增生的表达缺失率差异也有统计学意义（χ2=31.023，P<0.01）（表1，封三图5～7）。

3讨论

腹膜恶性间皮瘤（PMM）是一种原发于腹膜的高度恶性肿瘤，临床上较少见，病因和发病机制不明，部分病例认为与石棉接触有关。文献中报道男性患者居多[5]。本组资料中的病例全部为女性，与文献报道不一致，这与本地区从事手纺石棉工作的全部为女性有关。本组病例中30例有明确手纺石棉史，从事时间1.5～18年不等。

PMM发病缓慢，潜伏期可长达15～50年，发现时已多为晚期，又由于恶性程度极高，多数患者生存期不超过12个月。患病早期可出现腹部不适，常被患者忽略，在疾病晚期才出现腹水、腹痛及消化道梗阻等[5]。由于本地区是国内石棉加工行业的主要区域之一，2000～2010年女性腹膜恶性间皮瘤发病率为5.7/100万，PMM病例相对高发[7]。因此临床医师在遇到盆腔恶性肿瘤时常会询问患者有无石棉接触史，并会根据临床症状和影像学资料考虑到有无PMM这种少见盆腔恶性肿瘤的可能，本组病例中就有19例临床初诊为PMM。

PMM的诊断主要依靠病理学检查，结合有无石棉接触史以及影像学改变等资料进行综合分析。在进行病理诊断时需要与反应性间皮细胞增生、卵巢浆液性癌等多种良恶性病变进行鉴别诊断[4-5]。免疫组织化学检测最常采用国际上通用的两阳、两阴联合诊断方法，但是PMM的病理诊断仍然十分困难[3-5]。近年来研究发现，在恶性间皮瘤细胞的形成、生长、浸润和转移过程中，p16基因异常是最常见的基因改变。p16基因存在于正常细胞中，它是一个细胞周期素依赖性蛋白激酶，它调节RB通路，使细胞停滞于G0期或G1期，失去了CDK4的抑制作用，细胞过度增殖生长，导致肿瘤的发生、发展。荧光原位杂交（FISH）技术常应用于检测恶性间皮瘤p16基因的缺失[6，8]。Illei等[9]利用FISH检测95例胸膜间皮瘤冷冻标本中p16和MTAP基因的缺失情况，发现p16的纯合子缺失在大多数间皮瘤中均可检查到，在大多数病例中MTAP与其共缺失。对间皮瘤的组织学亚型进行分析发现，与上皮型相比，这种基因缺失更容易发生在肉瘤型间皮瘤中（包括混合型或者纯肉瘤型），但是并没有统计学意义，这可能是由于样本量较小造成的。多数研究还显示[10-13]p16的缺失可用于反应性和肿瘤性的间皮细胞增生的鉴别，而且FISH的敏感性及特异性均高于免疫组织化学方法，用FISH检测石蜡包埋组织中9p21纯合子缺失是診断恶性间皮瘤和间皮反应性增生的有效方法。本文研究结果显示，用FISH法检测出40例PMM标本中p16基因表达缺失率为45%（18/40），30例反应性间皮细胞增生标本中表达缺失率为0（0/30），PMM标本中p16基因的缺失率高于间皮细胞反应性增生，差异有统计学意义（P<0.01），运用FISH检测p16基因缺失在诊断和鉴别诊断PMM时有明确的病理诊断价值。

BAP1（BRCA-associated protein 1）是一种肿瘤抑制基因，其基因突变或表达水平的下调能够显著提高多种肿瘤的易患性。研究表明，BAP1 与许多肿瘤的发生发展关系密切[14-15]。一些研究显示BAP1还可以鉴别间皮细胞反应性增生和恶性间皮瘤[16-18]，与本文研究结果是一致的，本组资料中30例反应性间皮细胞增生标本均呈BAP1阳性表达（表达缺失率为0），而40例PMM标本中BAP1基因表达缺失率为65%，差异有统计学意义（P<0.01）。PMM在临床上常被误诊为卵巢浆液性癌，其在病理组织形态上也与卵巢浆液性癌十分相似，也需要进行鉴别诊断。Andrici J的研究显示[19-20]，BAP1在卵巢浆液性癌中的表达缺失率为0.3%，明显低于PMM的67%，与本文结果也是基本一致的。本组资料30例卵巢浆液性癌标本均呈BAP1基因表达缺失率为0，BAP1在PMM与卵巢浆液性癌的表达缺失率差异也有统计学意义（P<0.01）。本文研究结果表明BAP1在鉴别PMM与反应性间皮细胞增生和卵巢浆液性癌中均有重要价值。

综上所述，在PMM标本中p16基因常发生表达缺失。p16基因表达缺失在PMM的发生、发展中发挥重要的作用。运用FISH检测p16基因表达缺失是鉴别PMM与良性间皮细胞增生的一种有效的方法。而BAP1基因表达缺失与PMM也密切相关，这一免疫标记可以用于鉴别诊断PMM与反应性间皮细胞增生和卵巢浆液性癌，并能与其他诊断PMM的免疫组化抗体一同运用，提高PMM的病理诊断准确性。

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（收稿日期：2019-03-19）