学龄前儿童超重肥胖现状调查及肠道菌群检测结果分析

张冬雨 杨俊文 杨俊梅

随着经济的快速发展，人民的日常生活水平也在日益提高，饮食种类和习惯也有着巨大的改变，导致超重和超重肥胖也日益流行，全世界的超重肥胖人数占总人数的30%左右[1]。而随着家庭条件的改善，养育孩子观念也在发生变化，喂养条件和方式也日渐提升，因此现在“小胖墩”也是到处可见[2]。有流行病学研究预计[3]，到2020年全球范围内儿童超重肥胖症的发病率将超过9%。我国最近两年统计，6～18岁儿童中，超重肥胖的发病率已经占到10%左右了，城市中男孩超重肥胖的发生率能够达到12%，女孩差不多达到6.7%，所以儿童超重肥胖症的发病率越来越高[4]。学龄前儿童的超重肥胖问题也十分严重，超重肥胖已经严重影响到儿童的正常生活与健康，所以应该对其超重肥胖的原因进行研究[5]。

近年来有研究显示，肠道菌群在人体内环境中有着十分显著的作用，和人体很多类型的疾病有关，尤其是和超重肥胖症有着很重要的密切关系，肠道菌群的分布对儿童肠道中能量的平衡和调节意义重大[6]。本研究调查学龄前儿童超重肥胖现状，并检测学龄前儿童肠道菌群的分布，调查儿童超重肥胖和肠道菌群分布的关系，为学龄前儿童超重肥胖症的治疗和预防提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 调查本地区3所幼儿园儿童的超重肥胖情况，3所幼儿园共320人，其中男149人，女171人，年龄3～6岁，平均年龄(3.96±1.42)岁。

1.2 排除标准 排除因为遗传、药物、内分泌和代谢神经系统疾病有关的超重肥胖症；排除有便秘、腹泻、肠胃炎等肠道疾病的研究对象；排除1个月内服用过抗生素和益生菌的研究对象。

1.3 实验方法

1.3.1 调查超重肥胖情况 测量研究对象的身高体质量，按照国际算法计算BMI。超重肥胖标准按国际卫生组织推荐的标准，以不同年龄，不同性别的BMI指标为基础，确定超重肥胖。超重肥胖儿童为实验组，随机抽取30名正常儿童为对照组，检测其埃希氏杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、梭菌属等肠道菌群的数量。

1.3.2 粪便采集 符合要求的研究对象，在无菌干燥的采集盒中留取新鲜晨便，保存于4 ℃，并且在4 h以内送往实验室，保存于－80 ℃冰箱中。若无晨便习惯者，则在当天时间内采集，并保证4 h以内送往实验室。

1.3.3 粪便DNA提取 －80 ℃冰箱中保存的样本解冻后称取1 g的粪便，用粪便基因组DNA快速提取试剂盒(北京泰百克)提取粪便的DNA。提取后于－20 ℃保存备用。

1.3.4 荧光定量PCR 荧光定量PCR采用Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ试剂盒(Roche，德国)在Ligthcycler 480 Ⅱ PCR仪(Roche，德国)上进行。PCR引物根据埃希氏杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、梭菌属的16sDNA的V4～V5序列设计。PCR反应体系：cDNA模板4 μL，正向引物，10 μmol/L 0.5 μL，反向引物10 μmol/L 0.5 μL，LightCycler 480 SYSR Green Ⅰ Master (2×) 10 μL，补充水至20 μL。反应条件：95 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，40个循环。荧光信号采集温度为81 ℃。反应结束后分析扩增产物的溶解曲线，以判定扩增产物的特异性。梯度稀释已知拷贝数的标准质粒样品，同时进行PCR扩增，绘制标准曲线，计算各自基因的扩增效率。

1.3.5 数据处理 数据结果用Excel软件进行计算，用单因素变量方差分析法(ANOVA)分析样品间四种肠道菌属的数量差异，利用Dunnettt-Test(2-sided)进行多重比对。所有数据均用平均值±标准误差(SEM)的方式表示，利用GraphPad.Prism.v 5.0软件进行作图。菌群与BMI之间的相关性采用Pearson进行分析。P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 学龄前儿童超重肥胖现状 通过检测本地区3所幼儿园儿童的超重肥胖情况，结果显示3所幼儿园共320人，超重肥胖的儿童有31 人，占总数的9.69%，其中男17人，女14人，年龄3～6岁，平均年龄(3.57±1.76)岁，平均BMI(22.13±0.95)。选择的30名健康对照组儿童中，男16人，女14人，年龄3～6岁，平均年龄(3.62±1.53)岁，平均BMI(17.35±1.48)。实验组和对照组相比，其平均BMI和平均体质量差异有统计学意义，P＜0.05(表1)。

表1 两组儿童一般资料比较(±s)

表1 两组儿童一般资料比较(±s)

平均BMI 平均身高/cm 平均体质量/kg对照组 17.35±1.48 1.25±2.13 18.63±4.36实验组 22.13±0.95 1.36±1.96 23.46±6.26 P值 0.031 0.052 0.046组别 例数30 31平均年龄/岁3.62±1.53 3.57±1.76 1.242

2.2 两组儿童肠道菌群拷贝数的比较(表2，图1)荧光定量PCR检测实验组和对照组两组儿童粪便中埃希氏杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属和梭菌属四种肠道菌属的拷贝数，比较发现乳酸杆菌属和梭菌属在实验组和对照组儿童中的拷贝数差异有统计学意义(P＜0.05)，其中实验组乳酸杆菌属拷贝数比对照组儿童的多，而梭菌属拷贝数比对照组儿童的少；两组的埃希氏杆菌属、双歧杆菌属拷贝数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图1 两组儿童肠道菌群拷贝数的比较(Log 16SrRNA copies/g feces)

表2 两组儿童肠道菌群拷贝数的比较(Log 16SrRNA copies/g feces)

2.3 肠道菌群和BMI的相关性分析(表3) 采用Pearson分析肠道菌群和BMI的相关性结果发现，埃希氏杆菌属和双歧杆菌属与儿童的BMI没有显著的相关性(P＞0.05)、乳酸杆菌属与儿童的BMI呈现正相关性，且有显著性意义(r＝0.064，P＜0.05)，而梭菌属和与儿童的BMI呈现负相关性，且有显著性意义(r＝－0.173，P＜0.05)。

表3 肠道菌群和BMI的相关性分析

3 讨论

肥胖症已经是全球性问题，随着其发病率的逐年增多，大家已经意识到肥胖是一种病理状态。超重肥胖的危害很多，而儿童肥胖的危害更加严重和长远[7]。例如肥胖会增加患2型糖尿病(T2MD)的风险；相比正常体质量的儿童超重肥胖儿童患代谢综合征(简称MS)的可能性增加一半；对于超重肥胖的儿童，当其进入青春期阶段后，会容易出现经期紊乱，还增加了患早期多囊卵巢综合征的可能性；另外心脑血管疾病、呼吸系统疾病、身体外形、皮肤病和神经系统疾病等的患病概率也增加很多[8]。本研究调查分析了本地区3所幼儿园的儿童超重肥胖的情况，调查结果发现超重肥胖的儿童有31人，占总数的9.69%，其中男17人，女14人，年龄3～6岁，平均年龄(3.57±1.76)岁，平均BMI(22.13±0.95)。

近年来的研究表明，超重肥胖不仅仅是由于摄入的营养、能量代谢和运动失去平衡等外在因素和遗传等内在因素结合所导致的，肠道菌群也是肥胖的一大重要的环境因素[9]。有国外研究者研究结果表明[10]，肠上皮和消化系统的黏膜免疫组织以及肠道菌群一起构成了一个强大的肠内代谢调节系统。肠道菌群可以调节宿主的免疫和消化系统的营养代谢，甚至可以控制宿主的基因对储存脂肪的吸收，改变宿主的能量平衡。当肠道菌群的结构被破坏而失去平衡时，会导致宿主体内的内毒素增加，从而引发慢性炎症、肥胖、胰岛素抵抗等[11]。江美玲等研究者研究发现，2型糖尿病患者的肠道菌群失去平衡，而且发现拟杆菌属、球形梭菌等细菌的数量和患者的血糖浓度有着密切的相关性[12]。本研究结果分析显示超重肥胖儿童的肠道菌群发现，乳酸杆菌属和梭菌属在实验组和对照组儿童中的拷贝数差异有统计学意义，其中实验组乳酸杆菌属拷贝数比对照组儿童的多，而梭菌属拷贝数比对照组儿童的少。分析超重肥胖和四种肠道菌群的相关性发现，埃希氏杆菌属和双歧杆菌属与儿童的BMI没有显著的相关性，乳酸杆菌属与儿童的BMI呈现正相关性，且有显著性意义，而梭菌属和与儿童的BMI呈现负相关性，且有显著性意义。本研究结果为学龄前儿童超重肥胖症的治疗和预防提供研究基础与指导。