蛋白质组学技术在骨性关节炎发病机制中的应用

范春博杨永菊关雪峰*

(1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032)

1 骨性关节炎

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是全球最常见的运动系统疾病，也是一种致残率较高的疾病[1]。多见于中老年人群，主要表现为受损关节疼痛，可伴关节肿胀。畸形和活动受限等，病理特点是关节软骨破坏。软骨下骨硬化。骨赘形成和滑膜炎症[2]。其发病机制尚未清楚，目前国内外没有任何治疗手段能够显著控制其发展。同时也缺乏早期诊断方法[3]。因此寻找OA的发病原因。致病因子等成为了学者们研究的重点方向。

2 蛋白质组学技术

蛋白质组学(Proteome)的概念是1994年在意大利召开的双向电泳会议上澳大利亚学者Pandey和Mann[4]首次提出来的“一个基因组所表达的蛋白质”，1996年再次提出“在一定条件下，在某一个生命体系中由基因组编码的全部蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质”。蛋白质的空间结构和特异功能影响着生命个体的活动机制及外在表现。很多生物基因组中的蛋白质编码基因已被人类识别，但是蛋白质的表达并不稳定，蛋白质合成过程中产生了大量的蛋白质变体(proteoform)[5]，随着科学研究的深入蛋白质的研究方式已经无法满足科学活动要求，蛋白质组理念的提出以及一系列技术的发展则为蛋白质的研究提供了基础。蛋白质组学主要由蛋白质的分离技术、生物质谱技术和生物信息学组成[6]，新一代的抗体蛋白芯片技术也在逐步被研究者们所认可。当今蛋白质组学在生命科学领域发展迅速，为人类了解疾病的发生及发展的过程提供了新途径，新方法。

3 蛋白质组学技术在OA发生机制研究中的应用

3.1 蛋白质分离技术 蛋白质分离技术主要包括二维电泳技术、同位素标记相对和绝对定量技术、高效液相色谱技术[7]。

3.1.1 二维电泳技术 早期的蛋白质分离技术是二维电泳技术，原理比较简单是利用蛋白质分子量及等电点的不同，进行二次双向电泳蛋白质分离，但缺点也很明确，不能分离分子量很大或者很小的蛋白质同时技术难度大。工作周期长[8]。其中将二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术与等电聚焦技术相结合所形成的二维电泳是目前分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。廖伟雄[9]通过行关节镜诊治的12例KOA患者与12例非KOA膝关节疾病患者(半月板损伤10例，盘状半月板2例，均无明显关节软骨损伤)关节滑液标本，应用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳发现组织相容性白细胞抗原-DR(HLA-DR)、结合珠蛋白在KOA中表达上调，且与病情严重程度高度相关。Henrotin[10]等采用2D-DIGE技术对年轻健康志愿者与晚期关节炎患者进行对比研究.分析样本数据，在OA组发现了13种差异蛋白，运用免疫测定法发现Fib3-1、Fib3-2血清水平明显高于健康对照组，由此推断Fib3肽类是OA的潜在的标志物。

3.1.2 同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tag for relative absolutequantitation，iTRAQ)，则通过将蛋白质酶解为肽段，利用iTRAQ试剂与肽段的氨基或Lys的ε-氨基发生反应等量混合，再将标记的样本互相混合后，通过串联质谱进行分离鉴定[11]。梁海波[12]收集膝关节骨性关节炎患者60例，参照Kellgren-Lawrence(K-L)分级标准，分为 k-L0、I I、IV级的亚组，每个亚组随机选取10例男性与10例女性进行稳定同位素116、117、118的 iTRAQ标记。通过对不同样品的iTRAQ肤段实验标记共筛选出有意义差异蛋白169个。Fernández-Puente等[13]采用iTRAQ联合(MALDI)-TOF/TOF的方法，通过比较正常对照人群和OA中的血清样本，发现了300余种重复性和特异性很高差异蛋白，其中262种差异蛋白可以量化并计算其iTRAQ比，发现OA潜在生物标志物包括如脂蛋白、血管性血友病因子、软骨寡聚基质蛋白和四连接素等。

3.1.3 高效液相色谱技术 液相色谱技术得到了全面发展，气相色谱、液相色谱相互结合使用，可以高效的分离复杂的蛋白质复合物及肽段，造就了了自动化、高通量的检测手段，在蛋白质组学中得到广泛应用，但在OA研究中此项技术还未普及，将来可以列入OA炎性因子的筛选。对于完整蛋白质的分离与鉴定，Kelleher[14-15]所建立的四维离线分离平台就是利用蛋白等电位点的差异，通过对凝胶洗脱液相离截留电泳的离线分离，Ljiljana[16-17]则使用弱阳离子交换结合亲水交互液相色谱的在线分离方法也实现了完整蛋白质的高通量分离。

3.2 生物质谱技术 生物质谱技术在蛋白质组学中的应用越来越广泛，其中离子化技术和质谱仪是质谱技术的核心。高速运转的待测样本中的离子拥有不同的质荷比(m/z)进而分离和检测目标离子或片段，然后依据保留时间、丰度值进行定性和定量[18]。20世纪后期，电喷雾离子化(electrospray ionization，ESI)和基质辅助激光解吸附离子化(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)两大生物大分子离子化技术在电离时能够保持分子的完整性，由此大规模的蛋白质机械化鉴定成为可能，两者成了质谱离子化的重要手段，生物质谱技术也因此成为了蛋白质组学的一项支撑技术[19]。相比较这两种离子化技术各有千秋，ESI-MS与液相色谱联用则可用于分析复杂样品而MALDI适用于分析简单的肽混合物。质谱的质量分析器包括四种分析器都有自己的特点，根据不同的科研要求，各种质量分析器相互杂交形成了串联质谱仪。余光书[21]等采用定量蛋白质组学串联质谱标签标记技术，检测软骨组织标本取材于70-75岁行膝关节表面置换术的骨性关节炎患者的膝关节软骨组织，并提取线粒体。通过数据库检索得到294个蛋白质点的蛋白质有ATP合酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脱氢酶1等14种蛋白质存在于此线粒体对软骨细胞线粒体中的蛋白质作全面的定性观察。SINZ[22]等运用质谱测定法(MS)研究类风湿性关节炎、骨性关节炎患者的滑膜液和血浆，发现只在类风湿性关节炎患者的滑膜液中存在钙粒蛋白B，而血清淀粉蛋白A也只在类风湿性关节炎患者的血浆和滑膜液中被发现。MATSUO[23]等使用双向和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术相联合在骨性关节炎患者血清中鉴定出fibulin-4蛋白。

3.3 生物信息学技术 生物信息学是由计算机科学与应用数学、生物学等多种学科相互融合而形成的。它把DNA序列信息分析作为源头，对蛋白质的序列分析。结构分析。功能分析、点突变的设计及家族鉴定等进行研究。在获得蛋白质编码区的信息后进行蛋白质空间结构模拟和预测，运用计算机软件对所获得的实验数据进行存储及加工，然后利用先进的数据库分析，进行统计验证，从而获取数据所蕴含的生物学信息[24]。当今生物信息技术在OA方面研究还不够深入，研究者没还没有充分利用此学科进行OA的研究，OA的病因还未明确，所获得蛋白质的种类还未具体，蛋白质数据库还不够完善，这使OA的蛋白质组学的研究遇到了瓶颈。但是随着科技的进步，计算机算法及软件的快速更新、蛋白质数据库的不断完善都为OA蛋白质组学的研究发展提供了动力，综合各个方面的生物信息学必将成为揭示OA蛋白质密码的金钥匙。

3.4 抗体蛋白芯片技术 抗体蛋白芯片技术是新的蛋白检测技术。是建立在蛋白组学基础上的，应用抗体芯片(alltibody microarray，抗体微阵列)检测生物样品中蛋白表达模式的新方法[25]。抗体芯片技术的目的主要是通过检测不同病理组织的差异蛋白，通过发现的差异蛋白逆向推测疾病的演变过程，进一步指导临床用药及疾病的诊断与预防。抗体蛋白芯片技术的基本原理是将有需要的抗体固定于各种载体上作为待检测的芯片，之后用用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片发生反应[26]，漂洗洗去未能与芯片上蛋白质互相结合的成份，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的[27]。抗体芯片中的抗体有单克隆抗体和重组抗体。目前，比较普及的新一代的抗体蛋白芯片产品和技术，包括膜式和玻片式蛋白芯片，以及成套的ELISA试剂。蛋白芯片分为膜式和玻片式蛋白芯片，前者可以使用和Western blot相同的成像系统进行检测，极大的降低了蛋白芯片的使用门槛。玻片式蛋白芯片还有可定量的类ELISA的蛋白芯片，可在普通的激光可聚焦扫描仪上使用，可以极大的降低细胞因子的检测成本，适合于多指标(几十个到上百个指标)，小样本或者中等样本的检测。柴艺汇等[28]使用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞CYP24A，CYP27B蛋白的表达情况。结果发现示黄芪多糖的质量浓度在0.1，1，10mg-1时可以提高MC-3T3-E1成骨细胞的繁殖率且在48h促增殖作用最佳。新一代的抗体蛋白芯片适用方便，检测率高。目前在OA方面研究应用还不太广泛未来可广泛应用于OA的研究中。

4 总结与瞻望

蛋白质组学技术发展迅速，潜能巨大，紧随着蛋白质谱技术的创新进步，准确性、灵敏性及覆盖性方面均在不断提升。尽管目前蛋白质组学仍存在着，如研究芯片造价高、质谱结合率低等问题，但仍然是OA研究中新兴的技术方法。未来以蛋白质组学为手段研究OA的疾病过程会更加的普遍。同时蛋白质组学对OA研究应该以临床大样本为对象，从大样本进行分析筛选验证，从而寻找OA明确的生物标志物。同时单一的蛋白质组学难以解决更深层次OA的相关问题，将蛋白质组学与基因组学、转录组学和代谢组学等分子生物学结合可以更加立体直观的了解OA的发生发展机制。因此应以蛋白质组学做为桥梁，寻找OA的发病原因，以分子生物学做为基础深入研究，可在未来为人来研究OA的发生及发展机制提供更多的途径与方法。