蝎毒素多肽与钠通道特异性结合位点研究进展

章旭日，白占涛，3，刘 霞，3*

(1.延安大学生命科学学院；2.延安大学多肽资源药物研究中心；3.陕西省区域生物资源保育利用工程技术研究中心，陕西延安716000)

动物毒液是产毒动物捕捉猎物和抵挡天敌的重要工具，其成分复杂，其中的有效成分即毒素通常是肽和小分子化合物。肽类毒素具有不同的氨基酸序列、多肽长度、二硫键及折叠模式，通常由20到70个氨基酸残基、2到4对二硫键组成，二级结构稳定。毒素能靶向作用于各类离子通道而影响其正常运作。根据作用于通道上的方式，毒素分为孔区阻滞剂毒素和门控调节剂毒素，蝎毒素多肽属于门控调节剂毒素，能够与钠通道结合影响其门控特性，因此是研究靶向钠通道药物很好的工具。

研究普遍认为，蝎毒素多肽主要与通道上的VSD(Voltage-sensing Domain)结合而影响其门控特性，但二者结合的详细分子结构和功能机制目前尚不明确。近来，颜宁组利用高分辨冷冻电镜发现，同为门控调节剂的蜘蛛毒素Dc1a除与VSD结合外，还与细胞外环(连接着孔螺旋P2和孔区域中的S6区段)有结合点。正是基于这一新发现的提示以及目前该领域研究的诸多疑问，本文通过聚焦蝎毒素多肽与钠通道特异性结合位点研究的新进展，为该领域研究提出新思路和可供借鉴的一些参考。

1 蝎毒素

蝎毒素由20至70个氨基酸残基组成，其结构特征在于每个α螺旋通过2对二硫键与反向平行β折叠连接，在N端具三维结构，或一个延伸结构，或β片层[1]。蝎毒素的分类方法很多，根据不同的作用机制可分为神经毒素和细胞毒素；根据作用的对象，它分为哺乳动物和昆虫毒素；它还可以根据相对分子质量分为长链和短链蝎毒素，长链蝎毒素含有60到70个氨基酸残基。4对二硫键，主要作用于兴奋性细胞的钠通道；短链蝎毒素含20到40个氨基酸残基，3至4对二硫键，并且可以特异性作用于钾通道、氯通道和钙通道。不同类型蝎毒素多肽的结构和作用位点是不同的，因此根据蝎毒素的药理学和电生理学特性，将蝎毒素分为α蝎毒素和β蝎毒素两种，α蝎毒素作用在钠通道上位点3，减慢钠通道的失活过程，延长钠通道的开放时间；β蝎毒素对钠通道位点4的作用是影响钠通道的激活过程，激活相电压向超极化方向移动，对钠通道的失活无影响[2]。

2 钠离子通道

钠通道在产生膜兴奋性中起关键作用，并且是神经毒素的常见靶点。钠通道由一个α亚基(260 kD)，一个或数个β亚基(33～36 kD)组成[3，4]。α亚基是钠通道的功能性亚基，由四个结构域组成(DomainⅠ～DomainⅣ，DⅠ～DⅣ)，每个Domain含有六个跨膜片段(S1～S6)。这些结构相似但不相同的结构域由S1～S4电压敏感区组成，S4片段中每3个氨基酸残基中就有一个带正电的氨基酸。中间间隔2个疏水性氨基酸，其中正电荷氨基酸对膜电位变化产生反应，使通道产生开放或者关闭的构象。S5～S6则与每个结构域螺旋形排列在一起，在膜中形成钠离子选择孔。在哺乳动物中，钠通道根据α亚基结构的不同，可分为Nav1.1～Nav1.9和Nax十个亚型。其中亚型Nav1.1～Nav1.3和Nav1.6分布在中枢神经系统。Nav1.4、Nav1.5分布在肌肉组织中。Nav1.7～Nav1.9分布在周围神经系统[5]。不同的钠通道亚型具有相似的结构但功能不同。还可以根据其对河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是否敏感，钠通道亚型可以分为TTX敏感型(TTX-S)和TTX不敏感型(TTX-R)[6，7]，其中Nav1.1～Nav1.4、Nav1.6、Nav1.7属于TTX-S，并且纳摩尔浓度的TTX就能够抑制TTX敏感型，而TTX不敏感型只对微摩尔浓度的TTX具有反应[8]。离子通道和小分子配体组合调控通道开放或者关闭，从而控制钠离子的渗透性。其中钠通道在生理调控中起关键作用，因为其广泛分布表达在各种神经元中，当膜去极化达到阈电位，钠通道打开形成动作电位。因此，钠通道是神经系统正常运作的基础。如果钠通道被抑制，则不能形成动作电位，神经系统就将处于瘫痪状态。

3 蝎毒素与钠离子通道的互作机制

动物毒素能够与离子通道结合改变离子通道的开启或关闭，从而使猎物丧失抵御捕食者的能力。通常，改变电压门控离子通道功能的毒素通过两种机制起作用：一种是孔区阻滞剂，它是一种小分子神经毒素，如河豚毒素(TTX)和石房蛤毒素(STX)。它们主要通过与钠通道的孔区结合从而堵塞孔道，直接阻止了钠离子的通透；另一种是门控调节剂，它们通过与通道的电压感受域(voltage-sensing domain，VSD)结合[9]，改变通道构象，使通道开启或失活而影响门控效应。门控调节剂通常比孔区阻断剂具有更高的选择性，所以门控调节剂是研究VSD在通道激活和失活过程中复杂构象变化的有力工具，这也是钠通道亚型选择性药物开发的重要线索[10]。关于通道毒素与钠通道互作分子机制的相关报道很多，但没有得出它们相互作用的共识模型。早期研究表明，在门控调节剂与钠通道结合中，细胞外S3～S4环起到主导作用[11]，但随后的研究揭示S1～S2环在许多门控调节剂相互作用中的关键作用[12]。特别是近年研究表明，门控调节剂毒素之所以能够影响通道的门控是因为该毒素结合在S1～S4螺旋细胞外的空腔中，就像一个楔形物阻碍了电压传感器的运动[13]。所以有人提出，大的门控调节剂毒素，如蝎毒素，可能同时结合VSD和细胞外环(连接着孔螺旋P2和孔区域中的S6区段)[14]，但迄今并没有研究证实膜孔结构域螺旋与门控调节剂结合中的精确机制。所以，理解和阐明毒素对电压门控钠离子通道调控的结构基础至关重要。

3.1钠通道神经毒素结合位点3

钠通道的神经毒素结合位点3主要位于钠通道DⅣ的S1～S2胞外环和S3～S4胞外环，以及DⅠ的S5～S6的胞外环，被α-蝎毒素、海葵毒素和一些蜘蛛毒素占据，能够延缓或阻止钠通道的失活，诱导钠通道长时间开放[15，16]。α-蝎毒素是一类结构和功能相关的多肽神经毒素，每种都含有60到70个氨基酸残基，通过4个二硫键交联[17，18]。α-蝎毒素能够识别哺乳动物钠通道上的神经毒素结合位点3，通过大鼠脑钠通道上结合位点3与α-蝎毒素的结合力变化研究发现其结合力会因为通道去极化而降低，说明α-蝎毒素与位点3结合的电压依赖性与通道激活的电压依赖性密切相关[18，19]。并且毒素对通道失活的特异性作用表明，毒素与位点3结合后，改变了位点3的构象，阻止了通道的快速失活[20]。

通过光亲和标记、蛋白酶裂解、序列特异性抗体进行抗体定位以及与序列特异性抗体的结合阻断等方法对受体位点3的定位研究表明，α亚基DⅠ和DⅣ中的跨膜片段S5和S6之间的细胞外环参与了α-蝎毒素与位点3的结合。通过点突变实验说明，Nav1.2DⅣS1～S2胞外连接环上的T1560和S3～S4胞外连接环上的E1613以及S3跨膜片段上的F1610组成了Lqh2毒素与钠通道相互结合的高亲和位点，而在DI孔道区上的T393是Lqh2毒素的一个低亲和结合位点[21]。钠通道神经毒素受体位点3位于DⅣ中S4的细胞外侧[22]，S4段作为电压传感器，其序列中包含4～7个带正电荷的氨基酸残基，当膜去极化时，在电场影响下向外移动，引起通道的激活[23]。α-蝎毒素通过与S4片段胞外环的氨基酸结合，阻碍了结构域DⅣS4的运动，这改变了通道失活所必需的构象变化，最终延缓了通道的失活。这种毒素传感器捕获模型对门控修饰毒素具有广泛的适用性[24]。利用分子模拟实验，推测α-蝎毒素与钠通道相互作用的模型，在这个模型中，α-蝎毒素就像一个楔型物插入到DⅣ的S1～S2和S3～S4两个胞外连接环之间的缝隙中与通道发生相互作用。

3.2 钠通道神经毒素结合位点4

钠通道的神经毒素结合位点4主要位于钠通道DⅡ上S1～S2和S3～S4的胞外环以及DⅢ的孔道区。β-蝎毒素占据钠通道的神经毒素结合位点4，由4个二硫键交联，含60到65个氨基酸残基[25]，它通过改变钠通道的门控特性起作用。β-蝎毒素诱导电压依赖性钠通道向超极化方向移动和钠电流峰值的降低[26，27]。

Marcotte利用嵌合钠通道定位受体位点4，分析β-蝎毒素在嵌合钠通道上的活性。该嵌合钠通道具有来自心脏和骨骼肌或脑钠通道的结合域[28]。通过对通道上位点的突变和结构域取代的研究，发现在DⅡS1～S2上突变779位点的Glu或在DⅡS3～S4上突变837位点的Glu、840位点的Leu和845位点的Gly可使Css4对rNav1.2a不敏感[29]，用来自果蝇通道DmNav1的等效结构域替换rNav1.2a中的DⅡ可使AahIT对rNav1.2a不敏感[30]，表明DⅡ是必需的。通过研究发现大鼠脑钠通道受体位点G845N的单个氨基酸残基突变形成的嵌合体对毒素的亲和力显著降低且通道激活的电压依赖性没有向超极化偏移，说明G845N可以改变β-蝎毒素的电生理效应。因此，毒素与受体位点的高亲和性必须依赖于被激活的受体位点的结构状态。β-蝎毒素通过与S3～S4环的结合从而与激活状态下的钠通道DⅡS4片段的胞外末端相互作用。由于DⅡS4片段在去极化过程中向外移动，通过与DⅡS4片段胞外末端的结合，β-蝎毒素捕获了处于外部激活位置的DⅡS4片段，并将其固定，从而使得在面对后续去极化时加强了通道的激活，同时，激活的电压依赖性向超极化移动[31]。

β-蝎毒素是大分子配体，与α-蝎毒素类似，在DⅡS3～S4具有结合位点，与钠通道的细胞外结构域可能还有额外的结合点[25]。这方面的第一个证据是来自于Tityuszulianus的β-蝎毒素Tz1与通道相互作用的特异性研究，其中证实位于DⅢ孔道域C末端胞外环上的3个氨基酸残基决定了β-蝎毒素对不同亚型钠通道的作用[32]。另一证据是颜宁组利用高分辨冷冻电镜成像，解析了来自美洲小蠊的NavPaS钠通道及其阻断剂TTX/STX和其门控调节剂Dc1a的复合物结构[33]。Dc1a是一种来自沙漠灌木蜘蛛Diguetia的毒素，与β-蝎毒素相似，可以识别钠通道受体位点4，是一种门控修饰剂，它们使昆虫麻痹，对哺乳动物无毒，Dc1a可以促进德国蟑螂电压门控钠通道(BgNav1)的开放，对人类钠通道不敏感[34]。冷冻电镜结果表明Dc1a是与美洲小蠊NavPaS钠通道第二个VSD结合，结合后毒素的结构发生变化。由于毒素的第三与第四β折叠之间的环插入到VSD的近细胞外侧，它们两者之间形成很多氢键和范德华力，这些氢键和范德华力把VSD固定在激活状态，激活通道。该研究得到了高分辨率的毒素-通道复合物结构，可以清晰地看到TTX/STX与美洲小蠊的NavPaS钠通道的结合构象。该研究中发现TTX与STX在钠通道孔区与孔区选择性滤器域SF形成大量氢键，使SF堵在孔区，阻止了钠离子通过SF[33]。实验表明，门控修饰剂Dc1a能够同时结合VSD和孔道域螺旋发挥毒性，这类毒素有比先前认知的更复杂的毒性机制。

4 展望

蝎毒素多肽与钠通道的结合能够改变通道的门控特性，调控机体的生理过程。虽然两者之间的作用模式早已掌握，但由于钠通道的复杂性，对于两者间的精确作用机制尚不明确。随着计算机模拟技术和冷冻电镜技术的快速发展，我们将有能力进一步研究毒素与通道的精确作用机制，为理解蝎毒素多肽等门控修饰毒素的分子探针作用及以钠通道为作用靶点的药物研究、筛选、设计乃至开发利用提供参考。