H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

王楷宬 ，王素春，樊擎莹，孙亚伟，康京丽，汪 洋，刘华雷，黄保续

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种严重危害公共卫生和养禽业发展的传染病之一。AIV属于正黏病毒科A 型流感病毒属成员，由于其病毒基因组为分节段的单股负链RNA，故极易发生变异[1]。根据AIV 的致病性可将其分为低致病性禽流感病毒（low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）、高致病性禽流感病毒（high pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和非致病性禽流感病毒（non-pathogenic avian influenza virus，NPAIV）。以H5和H7亚型为代表的HPAIV 不仅严重危害养禽业发展，也严重威胁到了人类健康，因而得到了极大关注[2-4]。以H9亚型为代表的LPAIV 引起的症状相对轻微且死亡率低，因而未能引起足够重视，以至于H9亚型成为当前我国禽流感的主要流行型[5-6]。H9亚型AIV 在世界范围内广泛分布，在遗传进化上，可以分为北美系和欧亚系两大分支，其中欧亚系又进一步衍生出以BJ/94-like 或Y280-like、G1-like、Y439-like 以及F/98-like 等为代表的病毒亚群。根据新的亚系命名系统，我国H9亚型AIV 分离毒株主要来源于H9.4.2分支，其中4.2分支又演化为4.2.1～4.2.6分支。近年来，我国分离的H9亚型AIV 毒株主要为H9.4.2.5分支[7]。

研究[8-9]发现，H9N2亚型AIV 可由禽类跨种传播给其他哺乳动物，甚至是人类。葛菲菲等[10]报道，H9N2亚型AIV 在家禽中短期传播后，可突变成高致病性病毒。研究[11]显示，2013年在我国华东地区出现的H7N9亚型流感病毒中有部分基因片段来自H9N2亚型AIV。随着我国养禽业的飞速发展，在规模化养殖、活禽流通交易以及免疫压力之下，H9亚型AIV 势必威胁到公共卫生安全以及养禽业发展。H9亚型AIV 感染临床上主要表现为呼吸道症状，与其他呼吸系统疾病难以区分，更值得关注的是H9亚型AIV 可引起免疫抑制，故临床上常表现为H9亚型AIV 和其他病原的混合感染[12]。

为满足快速准确特异性检测H9亚型AIV 的需求，本研究建立了针对H9亚型AIV 的实时荧光RT-PCR 检测方法，评估了该方法的灵敏度和特异性，并将该方法应用于临床样品检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Primescript One step RT-PCR Kit Ver.2：宝生物工程（大连）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 核酸提取试剂盒：德 国QIAGEN 公 司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD；Optically clear flat 8 Cap Strips：Thermo Scientific。异丙醇、无水乙醇、RNaseA 等，均为国产分析纯试剂。

Qubit 核酸浓度测定仪及配套试剂：购自Life Technologies 公司；超净工作台：美国Forma Scientific 公司；移液器：Eppendorf；孵化器：德州诚信孵化设备有限公司；高速台式离心机：德国Heraeus Biofuge primoR；荧光定量PCR 仪：Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System。

1.2 毒株与核酸提取

各亚型甲型流感病毒、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）等毒株，均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存，毒株详细信息见表1。按照说明书操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取病毒RNA，并使用Qubit 核酸浓度测定仪及配套试剂测定RNA 浓度。

1.3 引物与探针筛选

参照NCBI GenBank 上发表的H9亚型AIV的血凝素（hemagglutinin，HA）基因序列，采用MEGA 6.0[13-14]进行序列比对分析，选取保守区域进行荧光检测引物和探针设计，并对多条引物、探针进行组合、筛选与检验，以筛选出最优引物和探针。

表1 病毒毒株信息

1.4 反应体系与条件

配制荧光定量RT-PCR 反应液，每管25 μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL、5U/μL TaKaRa ExTaqHS 0.5 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，以 及10 pmol/μL H9 forward、H9 reverse 和H9 probe 各0.5 μL，RNase Free H2O 8.0 μL，待检测样品RNA 模板2 μL。将检测反应条件设置为：第1阶段，42 ℃/5 min；第2阶段，95 ℃/10 s；第3阶段，95 ℃/5 s，60 ℃/20 s（收集荧光），40个循环。无Ct 值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct ≤36，且出现典型扩增曲线，样品判为阳性。

1.5 特异性与灵敏度评估

采用上述反应体系与反应条件，检测表1中的病毒RNA，以评估该检测方法的特异性。提取的核酸经Qubit 核酸浓度测定仪测定RNA 浓度后，将此病毒RNA 稀释为1 ng/μL，再依次10倍梯度稀释为10-1～10-6ng/μL；分别取2 μL 作为反应模板，按照前述加样方法进行实时荧光定量RT-PCR 核酸扩增。

1.6 临床样品检测

采集我国某市13个场点的禽咽喉拭子共384份，置于含有10% 甘油和抗生素（含青霉素2 000 IU/mL、链霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL、BSA 5 mg/mL）的PBS（pH7.2）缓冲液中，-80 ℃保存。将采集的样品涡旋混匀后，4 ℃ 10 000 r/min 离心5 min；取上清，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德 国）提取病毒核酸，-80 ℃保存。使用96孔反应管，加入上述反应体系，再分别加入待检样品RNA 进行检测。同时用国家标准《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法》（GB/T 19438.3—2004）中的荧光RT-PCR 检测方法，对384份临床样品进行检测，然后对比检测结果，分析本试验建立的方法在临床检测中的适用性。

2 结果与分析

2.1 引物与探针筛选

最终筛选出最适引物（H9 forward、H9 reverse）和探针（H9 probe），其中H9 probe 为TaqMan 荧光探针，标记HEX 荧光（表2）。

表2 最适引物及探针序列

2.2 特异性与灵敏度

结果显示，除H9亚型AIV RNA 模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线外，其他非特异性病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，此方法可以实现对AIV 的特异性检测，与其他相关病毒不发生交叉反应（图1）。本研究筛选的引物和探针组合能够保证检测时的灵敏性，检测灵敏度为RNA 终浓度10-4ng/μL（1.30×104copies/μL）。灵敏性试验结果见图2。

图1 H9亚型AIV 实时荧光定量RT-PCR检测特异性试验结果

图2 H9亚型AIV 实时荧光定量RT-PCR检测灵敏性试验结果

2.3 临床样品检测

用本研究建立的方法检出66份样品在CY5通道中有荧光信号，判定此66份样品为H9亚型AIV 阳性，与国标方法检测结果一致，符合率达到100%，表明本试验筛选的引物和探针通过荧光RT-PCR 方法检测H9亚型AIV 准确可信度高，可用于临床样品检测。

3 讨论

目前针对H9亚型AIV 的分子生物学检测方法有反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、环介导的等温核酸扩增技术和荧光RT-PCR 技术等[15]。实时荧光PCR 是在PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光PCR 可以分为SYBR-Green 荧光染料法和TaqMan 探针法。相比荧光染料法，探针法特异性强、灵敏度高，数据更准确[16-17]。

据研究[18-19]，自我国1994年首次报道从鸡群中分离到 H9亚型AIV 以来，绝大部分省份都有H9亚型AIV 的流行，给我国养禽业造成了巨大经济损失。目前国内研究[6，19-20]均显示，H9亚型AIV 在我国长期处于较高的流行态势，感染率仍在增高。本研究检测的临床样品H9亚型个体阳性率为13.75%，与其他调查报告基本相符，也表明了我国H9亚型AIV 感染率较高。

近年来，有关H9亚型AIV 混合感染的报道不断增多。H9亚型AIV 既可与其他亚型禽流感病毒混合感染，又可以其他病毒或细菌混合感染[21]。例如，H9亚型AIV 与禽偏肺病毒、IBV、NDV、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等混合感染，使得临床症状更加复杂，不易被确诊[22-25]。此外，混合感染往往呈现高发病率和高死亡率。

随着我国养禽业的飞速发展，家禽养殖集约化程度大幅提高，活禽运输交易越发频繁，导致AI 防控越发困难。在疫苗免疫压力以及环境压力下，H9亚型AIV 正逐渐发生变异。已有的研究[26-28]显示，我国不同地区H9亚型AIV 分离株的编码基因在遗传进化方面均发生了一定程度的变异，以至于现有疫苗不能提供充分的免疫保护。

H9N2亚型AIV 也参与了H7N9亚型病毒的重组，更有报道[11，29-30]称，H9N2亚型AIV 已跨越种间屏障，可直接感染人。近些年来，国内学者对我国不同地区H9亚型AIV 的HA 基因分子特征及遗传进化开展了相关研究[26，31-32]，均发现H9亚型AIV 呈现出了典型的人流感受体结合特征，只是目前尚未突破种间屏障，获得感染哺乳动物的能力，提示国内应加强对H9亚型AIV 的防控。

综上可见，H9亚型AIV 不仅严重影响养禽业发展，更是威胁人类健康的一大隐患。且我国的H9亚型AIV 基因还将进一步发生变异，故更需要加强H9亚型AIV 的监测。

H9亚型AIV 的不断重组变异，导致以往检测方法已经不能满足当前流行株检测的需要。故本研究根据H9亚型AIV HA 基因进行引物设计，根据基因比对，分析保守区域，经同源性分析后，筛选出一组特异性好、检测下限达10-4ng/μL 的探针、引物，并建立了高通量检测方法，应用于临床检测。经验证，该方法能够特异性地检测H9亚型AIV，可满足目前国内H9亚型AIV 流行株的检测需要，与国家标准GB/T 19438.3—2004中的荧光RT-PCR检测方法符合率达到100%，且能在1 h 能完成对未经培养临床样品的高通量检测，可以满足大规模流行病学调查的需要。