葛根红曲提取物对高脂饲料诱导肥胖小鼠的抗肥胖功效

何冬萍 朱晓萍 陈丽玲 刘志彬 倪 莉

（福州大学食品科学技术研究所 福建省食品生物技术创新工程技术研究中心 福州350108）

红曲霉（Monascus spp.）在生长过程会产生红曲色素、Monacolin 类物质等次级代谢产物。其中，红曲色素可作为天然食品色素应用于食品工业，而且还具有抗氧化、抗炎症、抗肥胖、调节胆固醇等作用[1]；而Monacolin K 是公认的具有降低胆固醇、血脂调节作用的药物[2]。红曲霉一般以糯米为基质进行发酵，最终产品称为红曲米，可用于黄酒酿造、食品发酵、红曲色素生产。除糯米外，也有研究者使用山药[3]、黑豆[4]等成分作为基质进行红曲霉发酵，获得功能性更佳的红曲色素产品。

葛根（Radix puerariae）是豆科植物，含有丰富的淀粉、黄酮等成分，具有良好的保健功能。其含有的黄酮类物质——葛根素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡，扩张血管，保护神经细胞与心肌细胞等药理活性[5]。以葛根替代传统糯米作为红曲霉发酵基质，可以为红曲霉的生长提供必要的碳源、氮源等营养素，同时葛根中的黄酮还具有调节红曲霉次级代谢产物的作用。此外，黄酮的引入有可能使红曲产品具有更好得保健功效。

本课题组前期以葛根作为基质，液态发酵红曲霉生产红曲色素，结果发现红曲色素产量得到显著提高，并能有效降低桔霉素含量，发酵产物还含有一定的黄酮含量，可能具有一定的抗肥胖、调节血脂等功效[6]。本研究通过小鼠动物实验评估该葛根红曲发酵产物的抗肥胖功效。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

1.1.1 动 物 40 只SPF 级4 周 龄C57BL/6J 小鼠，由上海斯莱克公司提供。

1.1.2 主要试剂 小鼠脂多糖结合蛋白（LBP）酶联免疫试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；Monaclin K，当地药店；标准饲料MD12062[16%脂肪，4.00 kcal/（g·m）]和高脂饲料MD12032[45%脂肪，4.73 kcal/（g·m）]，江苏美迪森生物医药有限公司。

1.2 仪器设备

TE601-L 电子天平，德国赛多利斯公司；AU2700 全自动生化分析仪，奥林巴斯（中国）有限公司；YXOSG41280 型高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂；CF16RXⅡ高速冷冻离心机，日立中国有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅，上海申腾科技有限公司；ULT1386-5-V41 型-80 °C 超低温冰箱，赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MRPE 的制备 将发酵得到的葛根红曲发酵液于4 500 r/min 条件下离心10 min，得到菌体，用去离子水洗涤3 次，加入70%乙醇溶液、混匀，超声20 min，于60 ℃条件下提取2 h，重复提取1次，4 500 r/min 条件下离心10 min，得到MRPE。将MRPE 冻干，过100 目筛得到MRPE 粉末，备用。

1.3.2 MRPE 成分测定 采用UV 法测定MRPE中色素含量[7]。将MRPE 粉末溶于70%乙醇溶液，稀释一定倍数后分别于410，465，510 nm 处测定吸光值，黄色价=OD410nm×稀释倍数，橙色价=OD465nm×稀释倍数，红色价= OD510nm×稀释倍数，总色价= 黄色价+橙色价+红色价，单位U/g。采用UV 法测定MRPE 中总黄酮含量，具体操作参考文献[8]。采用HPLC 测定MRPE 中的桔霉素含量，具体方法参考国家标准《红曲产品中桔青霉素的测定》GB/T 5009.222-2008[9]。采用HPLC 测定MRPE中Monacolin K 含量，具体操作参考文献[10]。

1.3.3 动物分组处理 实验动物饲养于福建省福建医科大学实验动物中心。将40 只小鼠饲养于同一间SPF 级屏障动物实验室的IVC 系统中，小鼠平均体重约为17.00 g/只。随机选取8 只小鼠喂食正常饲料（C 组），其余32 只小鼠用高脂饲料喂食诱导其形成肥胖，然后随机分成4 组，继续喂食高脂饲料并分别灌胃无菌水 （HF 组，n=8），Monacolin K（MK 组，n=8），正常剂量MRPE（MRPE-C组，n=8），高剂量MRPE（MRPE-H 组，n=8），为期4 周。红曲霉产品的每日推荐摄入量为1.0～2.0 g/成年人[11-12]，按体重换算为30 mg/kg，作为小鼠的正常灌胃剂量；以5 倍正常剂量（150 mg/kg）作为高剂量的灌胃剂量。Monacolin K 灌胃剂量约为300 μg/kg。饲养期间，饲养房间内明、暗交替条件为12 h/12 h 的光照循环，每天于晚上7 点关闭日光灯，早上7 点开日光灯。水量和饲料量充足，且小鼠饮水和摄食均自由。每天记录饮水量和摄食量，每周记录小鼠体重。

1.3.4 小鼠解剖与取样 小鼠饲养周期结束后，给小鼠禁食12h 后，称重后，取眼眶血，用肝素抗凝管收集血液。将小鼠拉直，用直尺量小鼠体长，即鼻尖到肛门的长度，并做好记录。剪开小鼠腹部皮肤，取下附睾脂肪、肠系膜脂肪、腹膜后脂肪，分别称重并记录。

1.3.5 Lee’s 指数 根据小鼠的体重与体长，计算Lee’s 指数。其计算公式为：Lee’s 指数=[体重（g）×1 000]∧（1/3）/体长（cm）。

1.3.6 血清生化分析 采血当日，取200 μL 小鼠血清于Olympus AU2700 全自动生化分析仪中测定血清中的总胆固醇含量 （TC）、甘油三酯含量（TG）、高密度脂蛋白胆固醇含量（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇含量（LDL-C）。

1.3.7 血清脂多糖含量测定 按照脂多糖（LBP）测定试剂盒操作说明书测定血清中脂多糖含量。

1.3.8 数据分析 使用 IBM SPSS 22.0 统计分析软件的Duncan 检验（P＜0.05）对试验数据进行样本间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 MRPE 成分分析

红曲色素是红曲霉代谢过程中产生的一系列聚酮化合物的混合物，属于复合色素。根据最大吸收波长的分布可分为三大类：红色素、橙色素和黄色素。现已发现100 多种红曲色素组分[13]，其中确定结构的仅有6 种醇溶性色素，即：具有橙色调的红曲玉红素 （Monascorubrine） 和红斑红曲素（Rubropunctatine）；黄色调的安卡红曲黄素（Ankaflavine）和红曲素（Monascine）；红色调的红斑玉红胺（Monascorubramine） 和红斑红曲胺（Rubropunctamine）[14]。从表1可以看到，MRPE 中总色价为（6 500.00 ± 181.87） U/g，远高于普通米粉发酵的红曲色素产量（50～2 500 U/g）。其中黄色素含量最高，其次是红色素，含量最少的是橙色素。MRPE 中Monacolin K 含量较少，（0.11±0.03）mg/g，远低于作为对照的市售Monacolin K 产品（980 mg/g）。本研究中使用的红曲霉FZU-MP1501（CGMCC No.12516）属于高产色素菌株，所代谢的Monacolin K 含量较少[6]。此外，桔霉素也是红曲霉的次级代谢产物之一，属于真菌毒素，其安全性受到质疑，也使得红曲产品的应用受到限制。据日本厚生省对于红曲产品中桔霉素的限量指标为每500 U 色素中桔霉素含量不超过0.2 μg[15]。本研究使用的MRPE 中桔霉素含量符合该标准。此外，MRPE 中的总黄酮含量为0.43%，表明葛根的添加使得MRPE 中有效活性成分更加丰富。

表1 样品的成分Table 1 The composition of the sample

2.2 小鼠的体重、体脂肪含量和Lee’s 指数

经13 周高脂饲料喂养，小鼠体重比正常饲料喂养小鼠高20%，诱导形成肥胖小鼠。对肥胖小鼠继续喂食高脂饲料并分别灌胃蒸馏水、MK、正常剂量MRPE 和高剂量MRPE，为期4 周，期间其体重变化如图1所示。灌胃4 周后，MK 组和样品组小鼠体重均显著低于HF 组 （P＜0.01），MK 组、MRPE-C 组和MRPE-H 组分别比HF 组小鼠的体重降低了9.80%，10.90%和13.00%。MRPE 两种剂量之间没有显著性差异 （P＞0.05）。结果表明MRPE 对肥胖小鼠的减重效果不逊于MK，利用葛根红曲提取物对肥胖小鼠有显著的体重控制效果。

图1 小鼠的体重变化Fig.1 Variation of body weight of mice

MRPE 及MK 处理4 周后，取小鼠的腹部附睾脂肪、肠系膜脂肪和腹膜后脂肪分别称重，并计算三者的总和及其与对应小鼠体重的比值，结果见图2。小鼠腹部解剖图见图3。从图2可以看出，3 个部位中附睾脂肪所占比例最大。HF 组肥胖小鼠体内脂肪堆积最为严重，附睾、肠系膜脂肪和腹膜后脂肪均为最高，总脂体比为（71.23±10.38）mg/g，比C 组高了1.84 倍。MK 组、MRPE-C 组和MRPE-H 组小鼠总脂体比显著低于HF 组，分别降低39.00%，19.10%和35.60%。与Monacolin K相比，MRPE-C 改善小鼠体内脂肪堆积的效果较弱（P＜0.05），而MRPE-H 组与MK 组没有显著性差 异 （P＞0.05）。MRPE-H 组小鼠总体脂比比MRPE-C 低20.43%，说明在减脂程度上MRPE 具有剂量依赖性。

Lee’s 指数为肥胖指标，综合考虑了小鼠的体重与体长，是目前评价肥胖程度方面的有效指数。一般来说，Lee’s 指数越大，肥胖越明显。从图4的Lee’s 指数可看出，灌胃4 周后，HF 组Lee’s指数最大，这与前面的结果趋势一致。综合以上结果可知，葛根红曲提取物可以防止小鼠体内脂肪堆积，对小鼠体重有显著的控制效果，在一定程度上具有剂量依赖性。

图2 各组小鼠各部位脂肪质量Fig.2 Weight of different adipose tissues

图3 小鼠腹部脂肪解剖图Fig.3 Anatomical pictures of abdominal adipose

2.3 肥胖小鼠血脂水平变化

从图5可以看出，小鼠经4 周不同药物灌胃后，MK 组、MRPE-C 组和MRPE-H 组小鼠的血清TC 水平均与HF 组有显著性差异（P<0.05），分别比HF 组低16.22%，10.46%和13.35%；各组小鼠血清TG 水平变化趋势与TC 水平一致，MK 组、MRPE-C 组和MRPE-H 组的血清TG 含量分别比HF 组低22.34%，28.13%和31.15%；MK 组、MRPEC 组和MRPE-H 组小鼠的血清HDL-C 水平均显著高于HF 组（P<0.05），分别提高了9.74%，8.83%和7.33%；血清LDL-C 水平中仅MK 和MRPE-H组与HF 组具有显著性差异（P<0.05），二者分别比HF 组降低了21.23%和14.88%，且MRPE-H 组的血清LDL-C 水平比MRPE-C 组低了8.22%，在一定程度上MRPE 呈现出剂量依赖效果。总的来说，葛根红曲提取物对肥胖小鼠血脂水平有显著的改善作用，与Monacolin K 效果相当。

图4 各组小鼠的Lee’s 指数Fig.4 Lee’s index of each mice group

图5 各组小鼠的血脂水平Fig.5 Plasma lipids of mices

2.4 血清LBP 水平

脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分。当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后会释放出脂多糖（LPS），导致机体炎症反应。而内毒素结合蛋白（LBP）是机体受到内毒素刺激时由肝脏合成的急性炎症反应蛋白，其含量多少可反应血液中内毒素的含量[16]。本试验将各组小鼠血液，按照试剂盒说明书测定血清中的LBP 浓度，结果见图6。MK 组、MRPE-C 组和MRPE-H 组的小鼠血清LBP 浓度均与HF 组有显著性差异 （P<0.05），分别比HF 组降低了40.44%，54.96%和50.46%，表明葛根红曲提取物在一定程度上降低血清LBP 能力强，具有一定的抗炎症能力。

图6 小鼠脂多糖结合蛋白（LBP）浓度Fig.6 Plasma LBP concentration of mice

3 讨论

本研究动物试验结果表明：MRPE 能够显著降低肥胖小鼠的体重、脂肪含量，以及血清TC、TG水平和LBP 含量，且显著提高血清HDL-C 水平，说明利用葛根作为基质得到的红曲发酵产物具有良好的抗肥胖功效。从成分分析结果看，由于菌株特性和发酵方式等的不同，MRPE 中成分主要以红曲色素为主，且MRPE 中成分较普通红曲米更为丰富，含有黄酮类物质。Jeun J 等[17]研究中，同样选用C57BL/6 肥胖小鼠进行有关红曲色素抗肥胖试验，该研究以100 mg/kg 饲料剂量的红曲橙色素作为肥胖干预物质来饲喂小鼠，剂量介于本研究正常剂量和高剂量之间，其结果表明橙色素显著降低了小鼠TC 水平 （实验组低于对照组约16%）、血清LDL-C 水平 （实验组低于对照组约26%）并提高血清HDL-C 水平（实验组高于对照组约9%）。可见，MRPE 能达到与纯化的红曲色素相当的降血脂效果，其中的黄酮组分可能发挥了一定作用。有趣的是，Chen 等[18]发现红曲米水溶性提取物（RMR-W）和醇溶性提取物（RMR-E）都能抑制3T3-L1 前脂肪细胞分化，其中RMR-W 还能提高成熟3T3-L1 脂肪细胞的脂肪分解活性，而RMR-E 和洛伐他汀却没有显著影响。可见，红曲色素的抗肥胖作用可能并非通过直接调节脂肪细胞实现。

本研究还发现，MRPE 具有降低血清LBP 的作用。肥胖会伴随轻度炎症，具有较高的血清LBP水平[19]。LBP 是来源于革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，目前有大量文献报道了肠道菌群的失衡有可能是导致血清LBP 提高的原因，进而引发炎症，加速肥胖的形成[20]。MRPE 的抗肥胖、降低血清LBP 的作用有可能是通过调节肠道菌群实现。后续需要进一步研究证实MRPE 的肠道菌群调节功能及其它可能的抗肥胖机制。