海南地区健康青年肠道中乳酸菌和双歧杆菌多样性研究

温永平 沈玲玲 孙志宏 江正强*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特010018）

肠道菌群占据人体微生物的绝大部分，这些微生物所包含的基因更是人类自身基因数量的100 倍以上[1]。肠道菌群组成和变化与人体健康及众多疾病的发生、发展密切相关。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB） 和双歧杆菌（Bifidobacterium，B.）是人体肠道中最为常见的益生菌，其中部分菌种已被多个监管机构赋予了“公认为安全”（Generally Recognized As Safe，GRAS）的地位[2-3]，在食品工业、畜牧行业及医疗卫生领域具有广泛应用。

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[4]。依据该定义，目前共有超过40 多个细菌属可以划归为乳酸菌[5]，常见的菌属包括乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属 （Leuconostoc） 和链球菌属（Streptococcus）等。乳酸菌可以通过多种机制阻止病原体在肠黏膜组织的粘附和繁殖，缓解肠道不良反应症状，并能将各种酶释放到肠道中，协同宿主消化[6]。而双歧杆菌属细菌具有保护肠道屏障功能的作用，增加双歧杆菌能降低非选择性肠道通透性，防止抗原/毒素从肠道进入宿主循环系统[7]。此外，乳酸菌和双歧杆菌通过产生可被其它肠道微生物利用的胞外多糖，有助于维持肠道微生物群落的稳定性[8]。

近年来，DNA 测序能力的提高及测序成本下降，为研究人员解析各类样品中微生物组成及宏基因组功能变化提供了有利条件。16S rRNA 基因扩增子测序被广泛用于评估样品中优势细菌和古细菌群落组成，包括人类微生物组计划（Human Microbiome Project）[9]、地球微生物计划（Earth Microbiome Project）[10]、塔拉海洋项目（Tara Oceans project）[11]等均通过将测序得到的细菌16S rRNA与参考数据库如Sliva、Greengene 比对获得样品中优势菌群组成。然而，乳酸菌和双歧杆菌在人体肠道中的相对含量往往较低，细菌16S 通用引物很难准确揭示这部分菌群的组成。鉴于此，本研究将乳酸菌特异性引物和双歧杆菌特异性引物扩增与PacBio SMRT 测序技术相结合，从种的水平探讨27 名海南地区健康青年肠道中乳酸菌和双歧杆菌的丰度和生物多样性，以期更为准确地揭示健康青年肠道中这两类菌群的丰度和多样性，并为后续研究提供有益参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验志愿者信息及样品收集 本研究共征集了27 名我国海南海口地区健康志愿者，详见表1。所有志愿者均为海南大学在校学生，身体质量指数小于30 kg/m2，并且在试验前6 个月未摄入抗生素。

1.1.2 主要试剂 MO BIO Power Fecal R DNA Isola tion Kit 试剂盒，美国Mo Bio 公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP mix、10x Easy Taq Buffer 等PCR 体系试剂，大连宝生物工程有限公司；5×TBE电泳缓冲液 （Tris 碱 54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g，定容1 000 mL，pH 8.0），1.0%的琼脂糖胶（1.0 g 琼脂糖溶于100 mL 0.5×TBE 缓冲液），天津基准化学试剂公司。

表1 志愿者信息Table 1 The information of volunteers

1.1.3 主要仪器、设备 PacBio SMRT RS II 测序平台，美国Pacific Biosciences 公司；Applied Biosystems PCR 仪，美国应用生物系统公司；ND-1000 型微量紫外分光光度计，美国赛默飞科技公司；CDS8000 型UPV 凝胶成像分析系统，上海赛智创业科学公司；HWS24 型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；Eppendorf 5810R 高速冷冻离心机，德国艾本德公司；Qubit 2.0，美国生命技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 所有样品采集均由志愿者个人完成，用实验室提供的无酶、无菌管采集约15 g的新鲜粪便样品，样品采集后立即加入15 mL 的保护剂，迅速冷冻，并尽快运回实验室，存放在-80℃冰箱内备用。

1.2.2 粪便细菌宏基因组DNA 提取 取0.3 g 充分混匀的粪便样品，采用Power FecalRDNA Isolation Kit 试剂盒，依照说明书的提取步骤抽提样品中细菌宏基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检验DNA 样品的完整度、纯度及浓度。上述3 个条件都满足后续试验要求的DNA 样品暂存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3 乳酸菌和双歧杆菌目的片段扩增、建库及测序 本研究用乳酸菌和双歧杆菌引物以及建库测序方法参考文献[12]。具体而言，乳酸菌引物为Lab-6F （5′-GCTCAGGAYGAACGCYGG-3′）和Lab-6R （5′-CACCGCTACACATGRADTTC-3′）；双歧杆菌引物为Bif-6F（5′-GGTAAGAGTCGGACGCTGTGCAATAA-3′）和Bif-6R （5′-GAAAGAAGAAGGCCACCAAGTAA-3′）。PCR 扩增程序设置为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，60℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共循环28 次；72℃终端延伸7 min，4 ℃终止。各样品的PCR 产物经AMPure beads 纯化后用PacBio SMRT II 测序平台配套试剂盒构建文库，根据厂商提供的说明书按如下步骤操作。

1.2.4 高质量序列的提取 使用SMRTRPortal 对原始序列进行质控，乳酸菌质控条件：①插入片段重复测序的次数≥5；②最小预测精确度为90%；③最短插入序列长度为650 bp；④最长序列长度为850 bp。对双歧杆菌的质控条件有所调整，将最小插入片段长度和最大插入片段长度分别设置为600 bp 和800 bp，其它质控条件相同。

1.2.5 生物信息学分析 下机数据的生物信息学处理基于QIIME（V1.7）平台完成，具体分析流程参考Hou 等[13]的方法。其中乳酸菌注释使用Greengenes（v13.8）、RDP （v11.5）和Silva（v128）3 个数据库，双歧杆菌注释使用从不同双歧杆菌菌种提取得到的rpsK 基因数据库。

1.2.6 数据处理 使用R 语言“ggplot2”包对QIIME 得到的结果进行数据可视化。使用“vegan”包中的anosim 函数进行多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，Permanova），计算影响志愿者肠道乳酸菌和双歧杆菌的主要因素。使用Wilcoxon 秩和检验、Kruskal-Wallis 多组检验比较两组和多组样品间指标差异。采用LefSe（Linear discriminant analysis effect size） 比较不同分组间存在显著差异的菌群。使用Spearman 相关性展示乳酸菌和双歧杆菌之间的相关关系。

2 结果

2.1 志愿者肠道中乳酸菌组成

2.1.1 测序量评估 所有样品原始下机数据量为70 535 条，经QIIME 初步处理后发现其中属于乳酸菌的序列为14 630 条（20.74%）。通过内部脚本提取这部分序列用于后续各样品乳酸菌多样性分析。稀疏曲线（图1a）和香农曲线（图1b）结果显示，虽然各样品中乳酸菌的最终测序量均未超过1 600 条序列，且稀疏曲线也未达到最终的水平状态，但大部分样品香农曲线均已达到水平状态。这表明随着测序量的增加，有可能检测到样品中更多的乳酸菌种系型。当前的测序量足以揭示样品中主要乳酸菌的组成。

在此基础上，进一步评估性别、年龄和BMI对志愿者肠道中乳酸菌丰度和多样性的影响。首先，按照WHO 基于BMI 值划分的亚洲人肥胖参考标准将所有志愿者进行分组，分别为BMI＜18.5偏瘦（Lean）、18.5＜BMI≤24.9 之间正常（Normal）、BMI≥25 肥胖（Obesity）[14]。结果发现男性肠道中乳酸菌丰度和多样性指标均显著高于女性 （图1c、1d、1e 和1f），而年龄和BMI 对此无显著影响（P＞0.05）。

图1 各样品测序量评估及肠道中乳酸菌的α 多样性比较Fig.1 Evaluation of sequencing quantity of each sample and comparison of gut LAB’s α diversity

2.1.2 志愿者肠道中乳酸菌组成 在属的水平，从所有志愿者肠道共鉴定到10 个乳酸菌属，平均相对含量在1%以上的菌属有6 个（图2a），主要包括链球菌属（58.41%）、乳杆菌属（23.87%）、魏斯氏菌属（Weissella，7.31%）、瘤胃球菌属（Ruminococcus，5.08%）、乳球菌属（2.48%）和肠球菌属（Enterococcus，1.86%）。此外，还鉴定到部分相对含量在1%以下的乳酸菌属，包括明串珠菌属（0.63%）、肉食杆菌属（Carnobacterium，0.12%）、毛螺菌属（Lachnospira，0.07%）和葡萄球菌属（Staphylococcus，0.05%）。由图2a 可知，不同个体肠道菌群中乳酸菌的组成及相对含量存在较大差异，整体上男性和女性乳酸菌菌群组成较为相似（图2b）。随着年龄的增加，魏斯氏菌属的平均相对含量出现上升趋势，其它菌属未发现规律性改变。此外，随着BMI 的降低，亦未发现规律性变化的乳酸菌属。

在种的水平上，从所有志愿者的样本中共发现86 个乳酸菌种，平均每名志愿者肠道乳酸菌菌种的数目为19 个。所有样品中，平均相对含量在1%以上的共有11 个菌种（图3a），主要包括唾液链球菌（Streptococcus salivarius，34.33%）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii，12.17%）、溶血性链球菌（Streptococcus gallolyticus，7.31%）、融合乳杆菌 （Weissella confusa，6.01%）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus，5.54%）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，3.78%）、婴儿链球菌（Streptococcus infantarius，3.69% ）、Ruminococcus faecis（2.35%）、副溶血链球菌（Streptococcus parasanguinis，2.12%）、乳酸乳球菌（Lactococcus garvieae，1.22%）和婴儿链球菌（Streptococcus infantis，1.10%）。由图3b 可知，不同年龄或BMI 的志愿者肠道乳酸菌种变化非常大，尚未发现规律性变化的乳酸菌种。值得注意的是，样本HN10 和HN11 肠道中德氏乳杆菌所占比例非常高，通过随后的回访发现，这两名志愿者平时均有饮用酸奶的习惯。

图2 志愿者肠道乳酸菌在属水平的组成Fig.2 Genus-level composition of LAB in the gut of volunteers

图3 志愿者肠道乳酸菌在种水平的组成Fig.3 Species-level composition of LAB in the gut of volunteers

2.1.3 志愿者肠道乳酸菌群肠型（Enterotyping）分析 根据志愿者肠道乳酸菌在种水平的组成进行肠型分析，结果显示所有志愿者可分为两个肠型（图4）。肠型Ⅰ（15 人）和肠型Ⅱ（12 人）人群主要由唾液链球菌组成，然而该菌在两个肠型人群中所占比例显著不同（P＜0.05）。具体而言，肠型Ⅰ人群肠道优势乳酸菌为唾液链球菌（18.96%）、德氏乳杆菌（16.70%）和S.gallolyticus（13.13%）；肠型Ⅱ人群优势乳酸菌为唾液链球菌（53.55%）、德氏乳杆菌（6.15%）和婴儿链球菌（4.69%）。两个肠型的人群组成与性别、BMI 和年龄之间没有明显关系。

图4 志愿者肠道乳酸菌种水平肠型分析Fig.4 Enterotyping analysis of gut LAB from volunteers at the species level

2.1.4 志愿者肠道乳酸菌群落结构的比较分析基于非加权UniFrac 距离的主坐标分析，可显示不同分组个体肠道乳酸菌菌群构成的差异。通过Premanova 分析统计各分组是否对志愿者肠道乳酸菌菌群产生影响。分析结果显示，年龄因素是造成不同志愿者肠道乳酸菌种类差异的主要原因（F=1.42，P=0.03），而性别（F=1.24，P=0.113）和BMI（F=1.16，P=0.119）对此没有显著影响。

基于不同分组进行LefSe 分析，发现乳酸乳球菌在21 岁志愿者肠道中的相对含量显著高于20岁的志愿者；与之相反，德氏乳杆菌则在20 岁志愿者肠道中的含量更高，其它分组中未发现存在显著差异的菌种。

2.2 志愿者肠道中双歧杆菌组成

2.2.1 测序量评估 从27 份样本共获得双歧杆菌测序序列81596 条，经OTU 划分，共得到OTU 9 745 个，平均每个样品得到的OTU 数目为581个（360～875，SD=139.4）（表2）。经Wilcoxon 秩和检验、Kruskal-Wallis 多组检验，所有分组α 多样性指数均无显著差异，说明志愿者肠道中双歧杆菌的丰度和多样性与志愿者年龄、性别和BMI 指数不相关。

2.2.2 志愿者肠道中双歧杆菌的组成 从所有志愿者测序数据中共鉴定到9 个双歧杆菌种，平均相对含量在0.5%以上的共有5 个，结果如图5所示。主要菌种包括链状双歧杆菌（B.catenulatum，40.05%）、长双歧杆菌（B.longum，37.12%）、粪双歧杆菌（B.stercoris，24.70%）、两歧双歧杆菌（B.bifidum，6.11%）和青春双歧杆菌（B.adolescentis，0.53%）。其余含量较低的双歧杆菌还包括动物双歧杆菌 （B.animalis，0.34%）、短双歧杆菌（B.breve，0.27%）、B.kashiwanohense（0.18%）和齿双歧杆菌（B.dentium，0.16%）。

基于图5发现了一个很有意思的现象，所有样本以加权UniFrac 距离进行UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic means）聚类时，样品可以分为3 个类群，各类群的代表性菌种分别为链状双歧杆菌、粪双歧杆菌和长双歧杆菌。

表2 所有样本中双歧杆菌测序量和α 多样性指数Table 2 Sequencing depth and α diversity index of Bifidobacterium in all samples

为了进一步验证性别、BMI 和年龄对志愿者肠道双歧杆菌可能的影响，对3 组样本进行差异显著性检验，结果显示：男性志愿者肠道中B.kashiwanohense 的相对含量显著高于女性（P=0.02）。此外，动物双歧杆菌、链状双歧杆菌和B.kashiwanohense 在肥胖人群中的相对含量显著高于正常人群（P＜0.05），而年龄与双歧杆菌的组成之间没有明显关系。本研究还发现粪双歧杆菌和长双歧杆菌主要在女性志愿者肠道中出现，长双歧杆菌含量较高的个体全部属于BMI 正常的志愿者。

2.3 志愿者肠道中乳酸菌和双歧杆菌相关性分析

为了揭示肠道中乳酸菌之间、双歧杆菌之间以及乳酸菌和双歧杆菌之间的相关关系，对样品中的主要乳酸菌和双歧杆菌进行Spearman 相关性分析，结果如图6所示。在乳酸菌属的水平上，链球菌属与乳杆菌属极显著负相关（P＜0.001），与瘤胃球菌属显著负相关（P＜0.05）。在乳酸菌种的水平上，德氏乳杆菌与食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳酸乳球菌显著正相关（P＜0.05）。双歧杆菌菌种方面，B.kashiwanohense 和链状双歧杆菌极显著正相关（P<0.001），与长双歧杆菌显著负相关（P<0.05）；链状双歧杆菌和粪双歧杆菌、长双歧杆菌极显著负相关（P<0.01）。粪双歧杆菌与两歧双歧杆菌显著正相关（P<0.05）。乳酸菌种和双歧杆菌菌种相关性方面，仅有德氏乳杆菌和B.kashiwanohense 显著正相关（P<0.05）。

图5 志愿者肠道双歧杆菌相对含量Fig.5 The relative abundance of Bifidobacterium in gut of volunteers

图6 志愿者肠道乳酸菌和双歧杆菌的相关性Fig.6 Spearman’s rank correlation between LAB and Bifidobacterium in the gut of volunteers.

3 讨论

乳酸菌和双歧杆菌是人体肠道的代表性益生菌群，然而这两类菌在成年人体内的相对含量均比较低[15]，基于16S 通用引物很难揭示这部分菌群的组成。之前，Zhang 等[16]使用荧光定量PCR（qPCR） 对粪便样品中的部分乳酸菌属和双歧杆菌属进行定量分析，也仅从属的水平分析部分菌属的含量。此外，qPCR 分析受限于不同菌群的特异性引物，试验和分析过程耗时费力。本研究基于乳酸菌和双歧杆菌特异性引物对粪便样本中上述菌群进行扩增，同时利用三代测序的长读长优势，准确揭示海南地区青年人群粪便样本中乳酸菌和双歧杆菌的多样性构成。

本研究在所有志愿者肠道中共检测到86 种乳酸菌种和9 个双歧杆菌种，远大于常规16S 测序所能检测到或qPCR 所能定量到的乳酸菌和双歧杆菌数量。不同志愿者肠道中乳酸菌和双歧杆菌组成存在较大差别，这可能与每个人平时的饮食习惯等直接相关，这是因为随访时发现，在肠道中德氏乳杆菌相对含量较高的HN10 和HN11，平时均有饮用酸奶的习惯。之前有研究表明：性别、年龄和BMI 是影响人体肠道菌群组成的重要因素[17-18]。本研究亦分析了上述因素与青年人群肠道中乳酸菌和双歧杆菌的关系，结果发现虽然男性志愿者肠道乳酸菌丰度和多样性指数均显著高于女性，但基于非加权UniFrac 距离的主坐标分析却显示两组志愿者没有显著差异，这说明在乳酸菌的种类上男、女之间并没有显著差异，然而男性中各类乳酸菌相对含量分布更为均匀，且丰度也更高。这与Yoshio Suzuki[19]基于酸奶消费对青年人群肠道菌群影响男女有别的研究结果类似。造成该结果的原因可能与男性和女性发育成熟速度有一定关系，需进一步验证。本研究显示：年龄是影响志愿者肠道中乳酸菌多样性的重要因素，然而纳入这项研究的所有志愿者年龄差别并不大（21～24 岁）。通过回访这些志愿者发现，不同年龄段志愿者在海南大学所处的学习阶段不同，低年龄段的志愿者主要在学校学习理论知识，饮食、作息等均为典型的校园生活模式，而高年龄段的很多学生已经开始进行课外实习，长期在外奔波，饮食、作息均与在校时发生了较大改变，这些均会对肠道菌群及乳酸菌构成带来显著影响[20-21]。

乳酸菌种水平的肠型分析显示，两个肠型的代表菌种均为唾液链球菌，尽管该菌在两个肠型人群中的比例存在显著差异。唾液链球菌是出生后人类口腔和肠道的首批定殖者之一，该菌也定植在胃和空肠中，其对于口腔和消化道生态起着重要作用[22]。此外，还有研究表明，唾液链球菌能够通过抑制病原体激活的炎症途径影响免疫反应，这表明其在调节人类上皮细胞免疫反应中发挥了重要作用[23-24]。Ghalia 等[25]研究发现，从口腔分离的唾液链球菌能够在体外和体内预防炎症反应。根据肠道中优势菌群双歧杆菌的不同，可以将志愿者分为以链状双歧杆菌、长双歧杆菌、粪双歧杆菌为优势菌的3 个类群，性别和BMI 均会对双歧杆菌组成产生影响。Kerckhoffs 等[26]研究发现，与健康人相比，链状双歧杆菌计数在肠易激综合征患者十二指肠黏膜显著下降。之前的研究发现长双歧杆菌部分亚种可以利用多种不同的寡糖，使其在与其它肠道菌群的竞争中占据优势[27]，其还可以分泌一种小聚糖或糖脂，通过下调各种胎儿细胞培养模型中的TLR4 和验证信号来预防上皮炎症反应[28]。使用长双歧杆菌制备的发酵豆奶处理人肠上皮细胞系HT-29，可以有效降低TNF-α 诱导的IL-8 的产生[29]；长双歧杆菌对于结肠癌的发生亦有抑制作用[30]。粪双歧杆菌是2010年从健康青年肠道中分离得到[31]，目前对于该菌益生作用的研究较少。基于目前的研究结果，志愿者肠道中优势的乳酸菌和双歧杆菌多具有一定的益生功效，这对维持人体健康十分重要。本研究基于乳酸菌和双歧杆菌在不同志愿者肠道中的组成进行相关性分析，发现无论是乳酸菌之间、双歧杆菌之间亦或是乳酸菌和双歧杆菌之间均有部分菌群存在显著相关关系，菌群间的相互平衡和制约是肠道菌群维持稳定的原因之一。

4 结论

海南地区青年人群肠道中拥有丰富的乳酸菌和双歧杆菌，其中乳酸菌主要由唾液链球菌、德氏乳杆菌、溶血性链球菌、融合乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等组成，双歧杆菌主要由链状双歧杆菌、长双歧杆菌、粪双歧杆菌和两歧双歧杆菌组成。饮食习惯和性别以及性别和BMI 分别是肠道乳酸菌和双歧杆菌组成的重要影响因素。肠道中优势乳酸菌和双歧杆菌对人体健康发挥重要作用，而一些新分离鉴定菌种的益生功效还需后续研究揭示。本研究所采用的PacBio SMRT 三代测序技术结合特异性引物的方法在种水平揭示了肠道中特定菌群的组成，这对后续研究的开展具有很好的指导意义。