氨基糖苷类抗生素生物合成研究进展

李思聪 孙宇辉

(武汉大学药学院，武汉 430072)

图1 常见的氨基糖苷类化合物Fig.1 Amino glycoside compounds

氨基糖苷(aminoglycoside)抗生素是以氨基环醇为母核，并含有氨基糖环和糖苷键为结构特征的一类化合物。1944年，第一例氨基糖苷类抗生素链霉素(streptomycin)从灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中被发现(图1)[1]，由于对结核分枝杆菌表现出的优良活性，成为当时治疗肺结核的特效药，其发现者Waksman于1952年获得诺贝尔生理学或医学奖。此后，氨基糖苷类抗生素的发现、分离与鉴定进入黄金时代，更多的氨基糖苷类抗生素被发现并应用于临床，如1949年，Waksman等[2]从弗雷德链霉菌(Streptomyces fradiae)中发现的新霉素(neomycin)；1957年，Umezawa等[3]从卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)中发现的卡那霉素(kanamycin)；1963年，Weinstein等[4]从棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)中发现的庆大霉素(gentamicin)；1967年，Higgins等[5]从黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)中发现的妥布霉素(tobramycin)，以及Weinstein等[6]于1970年从伊尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中发现的西索米星(sisomicin)等(图1)。尽管结构上各有差异，但它们发挥作用的基本原理都是通过特异性地结合于细菌核糖体30S小亚基16S rRNA的氨酰-tRNA位点，干扰细菌蛋白质合成，从而表现出对细菌，尤其是革兰阴性菌优异的杀灭活性[7-9]，因此被广泛应用于临床治疗，对人类的健康做出了极其重要的贡献。近年来，随着耐药性的日益严重，氨基糖苷类抗生素通过与β-内酰胺类抗生素的协同作用，也成为控制多重耐药菌的重要策略之一[10]。同时，随着研究不断深入和拓展，氨基糖苷类抗生素更多新的生物活性被揭示出来，如在抗病毒方面，以庆大霉素为代表的氨基糖苷类抗生素可抑制HIV相关多肽与反式激活响应(trans-activation response,TAR)RNA的结合[11]；庆大霉素及其代谢中间产物G418能够恢复由无义突变引起的翻译提前终止(premature termination codon,PTC)，从而激活肿瘤细胞中的抑制因子p53，使肿瘤细胞凋亡[12-13]，这一新发现赋予了这一传统药物在癌症治疗方面的巨大潜力。此外，庆大霉素还可以作为增感剂，通过与喜树碱、洋地黄毒苷和长春花碱等联用，在体外显著提高对肺癌细胞NCI-H460的抑制和杀灭活性[14]。令人鼓舞的是，2018年6月26日，美国FDA批准Achaogen公司基于西索米星经化学修饰而获得的plazomicin(商品名ZEMDRITM)用于治疗多重耐药性革兰阴性菌导致的严重感染(图1)。它能克服多种氨基糖苷钝化酶对抗生素分子的破坏，是针对多重耐药性革兰阴性菌感染的最新一代氨基糖苷类抗生素。这些新活性的揭示，向人们展示出氨基糖苷这一曾经辉煌的经典药物“宝刀未老”，依然绽放出新的锋芒。因此，进一步发掘氨基糖苷抗生素结构和活性的潜力，成为了人们新的期待。

为了深入挖掘氨基糖苷类抗生素的潜力，特别是运用现代合成生物学和代谢工程等方法对其进行结构优化和定向改造，全面彻底地阐明其生物合成途径是实现这一目的的重要前提。在以庆大霉素为代表的基糖苷类抗生素生物合成早期的研究中，美国先灵公司Testa和日本协和发酵工业有限公司Kase等利用传统理化诱变方法随机获得一系列庆大霉素生物合成阻断突变株，通过对其发酵产物结构的鉴定和分析，并结合同位素标记前体喂养，推导出庆大霉素可能的生物合成途径[15-18]。直到进入21世纪，基因组测序技术的快速发展以及基糖苷类抗生素产生菌遗传操作系统的突破，大大加速了其生物合成机制探索的进程。来自遗传学、生物化学及化学生物学，特别是结构生物学的国内外研究进展使其生物合成过程正逐渐清晰，为老药新用的理性定向改造提供了理论支撑。

根据氨基糖苷类抗生素结构差异，可将氨基糖苷化合物分为两大类型，即氨基环醇(aminocyclitol)型和2-脱氧链霉胺(2-deoxystreptamine,2-DOS)型。对于后者，又可根据母核上的糖环取代基，分为4,5-二取代型、4,6-二取代型和单取代型。本文将对常见的天然和化学半合成氨基糖苷抗生素生物合成的研究进展进行简要的概述和总结。

1 氨基环醇型氨基糖苷抗生素的生物合成

该类型抗生素都具有氨基环醇的六元碳环结构，其合成起始化合物均为肌醇(myo-inositol)。由于共有的母体结构，因此这类抗生素的生物合成共用肌醇的生物合成途径，其生物合成途径为：肌醇-1-磷酸合酶将葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)催化生成肌醇-1-磷酸(myo-inositol-1-phosphate)。然后在磷酸酶的作用下去磷酸化，产生肌醇[19-21]。肌醇作为合成的起始化合物，参与所有氨基环醇型氨基糖苷抗生素的生物合成(图2)。对于该家族最著名的成员——链霉素，首先在脱氢酶StrI的作用下，肌醇C-2位羟基被氧化形成鲨肌醇单酮(scyllo-inosose)[22]，随后氨基转移酶StsC将羰基转化为氨基，生成鲨肌醇糖胺(scylloinosamine)[23]。该中间体被磷酸基和脒基修饰，形成链霉胍-6-磷酸(streptidine-6-phosphate)。根据推测，它与一个结构独特的五元糖环—链霉糖(streptose)相连，形成拟二糖(pseudodisaccharide)结构，再与一个葡萄糖环相连，形成拟三糖(pseudotrisaccharide)骨架。此外还需要经过脱氢、氨基化和甲基化等多步后修饰才能最终合成链霉素(图2)[24]32.2kDa (StrL)。虽然链霉素以链霉胺为母核，但在生物合成途径中，并不直接产生链霉胺[25]。此外，如果链霉素C-3'位侧链上的羰基被羟甲基取代，则形成双氢链霉素(dihydrostreptomycin或bluensomycin)，它可能与链霉素的生物合成相关联[26]。

图2 氨基环醇型氨基糖苷抗生素生物合成途径及其氨基糖苷家族成员Fig.2 Biosynthesis of aminocyclitol and its members

在该家族另一重要成员壮观霉素(spectinomycin)的生物合成中，根据Sohng研究组异源表达的研究结果，肌醇的C-1位的羟基被脱氢酶SpcB催化氧化，产生L-肌醇单酮(L-myo-inosose)，然后通过氨基转移酶SpcS2催化产生L-肌醇糖胺(L-myo-inosamine)，再经过一轮类似的酮基氨基化反应，便产生链霉胺的差向异构体2-epi-链霉胺(2-epi-streptamine)[21]。而它的N-1和N-3位被甲基转移酶SpcM修饰，生成放线胺(actinamine)。糖基转移酶SpcG将放线胺与壮观糖(spectinose)环相连，形成拟二糖结构，同时放线胺环的羟基与壮观糖C-2'位羰基与形成半缩醛结构，即为壮观霉素(图2)[27]。关于其结构单元壮观糖的合成，根据推测，SpcD能够将葡萄糖-1-磷酸活化为成dTDP-葡萄糖，它分别经过脱水酶SpcE、转氨酶SpcS1和脱氨酶SpcH等蛋白的催化作用，形成dTDP-壮观糖，随后被加载至母核[27]。

潮霉素(hygromycin)A也是以肌醇为生物合成前体，但脱氢的位置却不相同，肌醇C-5位的羟基被脱氢酶Hyg17催化氧化生成5-酮基-肌醇(5-keto-myoinositol)(图2)，随后在肌糖转氨酶Hyg8的催化作用下生成2L-2-氨基-2-脱氢肌醇(2L-2-amino-2-deoxy-neoinositol)，它的两个羟基与一碳单元形成双氧桥五元环之后与核苷类结构单元相连，即为潮霉素A[28]。

福提霉素(fortimicin)具有独特的母核结构，其中福提霉素B的母核上有两个氨基以及两个甲基修饰，而福提霉素A在此基础上还有氨乙酰化修饰。从结构上来看，福提霉素也属于氨基环醇家族，其生物合成基因簇虽已报道，但其生物合成途径目前还难以确定，只有少数基因，如磷酸转移酶ForP编码基因的功能已被阐明，它催化3'-OH的磷酸化，该修饰可能是脱双羟基的前期步骤[29]。

2 2-DOS型氨基糖苷抗生素的生物合成

此类抗生素以2-DOS为母核，且来源广泛，在链霉菌(Streptomyces)、小单胞菌(Micromonospra)、芽孢杆菌(Bacillus)等不同菌株中，该母核的生物合成过程基本相似。关于2-DOS生物合成途径的探究最早源于1974年，Reinhart等[30]在对新霉素生物合成途径研究时，通过同位素标记前体喂养，发现2-DOS来源于D-葡萄糖。随后Daum等[31]发现2-脱氧鲨肌醇(2-deoxy-scyllo-inosose,2-DOI)也可以作为中间体参与生物合成。从葡萄糖到2-DOI的生物转化过程，则是由Kakinuma等[32-33]通过氘代葡萄糖喂养核糖霉素(ribostamycin)产生菌Streptomyces ribosidificus所揭示。Nakayama研究组和Kondo研究组[34-36]分别从沙加霉素(sagamicin)产生菌和丁酰苷菌素(butirosin)产生菌突变株中发现了2-脱氧鲨肌糖胺(2-deoxy-scylloinosamine,2-DOIA)的积累。另外，Chen等[37]从新霉素和庆大霉素的产生菌发酵产物中发现2-脱氧鲨肌糖胺单酮(keto-2-deoxy-scyllo-inosamine，keto-2-DOIA)可作为2-DOS生物合成前体(图3)。

随着分子生物学技术的发展，对于2-DOS生物合成途径的揭示也逐渐深入到基因水平。1999年，Kakinuma研究组[38-39]首次从丁酰苷菌素的产生菌Bacillus circulansSANK 72073中克隆出2-DOI合成酶编码基因btrC，为利用其为探针发掘和克隆2-DOS类抗生素生物合成基因簇提供了参考序列。随后，该研究组通过体外蛋白催化鉴定出转氨酶BtrS是催化2-DOI到2-DOIA氨基转移关键酶[40-41](两个基因btrN和btrS)。值得注意的是，在keto-2-DOIA到2-DOS的氨基转移过程中，BtrS同样可以发挥其氨基转移功能[40-41](两个新基因btrN和btrS)。该现象在新霉素产生菌中也同样存在，Neo5作为与BtrE高度同源的脱氢酶，参与2-DOIA到keto-2-DOIA的生物催化过程；Neo6作为与BtrS高度同源的氨基转移酶，同样可以参与2-DOS生物合成中的两步氨基转移反应[42-43]。在不同氨基糖苷类抗生素的2-DOS生物合成途径中，具有相同功能的酶在结构和催化机理上往往高度相似。但对于2-DOIA脱氢酶，却存在两种差异明显的类型，一种以来自新霉素生物合成途径的NeoA为代表，它们使用NAD+或NADP+为辅因子[43]，另一种以来自丁酰苷菌素生物合成途径的BtrN为代表，为radical SAM(S-adenosylmethionine)依赖的脱氢酶，它使用铁硫簇([4Fe-4S]型)为辅因子[42]。

图3 2-DOS生物合成途径及其氨基糖苷家族成员Fig.3 Biosynthesis of 2-DOS and its members

在合成2-DOS母核之后，因C-4或C-5糖基取代的不同可进入不同的2-DOS型氨基糖苷抗生素生物合成途径(图3)。其中，巴龙霉胺(paromamine)是众多2-DOS类抗生素生物合成途径中的第一个拟二糖。早期，Testa等[15]通过喂养巴龙霉胺，可以恢复西索米星产生菌M.inyoensis的2-DOS营养缺陷型突变株中西索米星的产生；此外，Pearce等[44-45]也发现在新霉菌和巴龙霉素(paromomycin)产生菌的2-DOS营养缺陷型突变株中喂养巴龙霉胺，可以分别恢复新霉菌和巴龙霉素的产生；同样，Takeda等[46]也发现巴龙霉胺也可以参与丁酰苷菌素的生物合成；此后，Goda等[47]通过同位素示踪标记证实新霉素中C-6'氨基的产生是在巴龙霉胺合成之后。这些研究结果说明巴龙霉胺作为通用的中间体，广泛地参与2-DOS氨基糖苷类抗生素的生物合成过程。而参与巴龙霉胺生物合成相关基因的克隆和功能研究，则远迟于此，直至2005年，Kudo等[42-43]通过氨基酸序列分析，才定位了酰苷菌素生物合成基因簇中N-乙酰葡萄糖胺转移酶BtrM编码基因，并推测它可能负责在2-DOS上加载葡萄糖胺形成巴龙霉胺。2007年，Spencer研究组最终通过体外蛋白催化实验，证明BtrM首先催化N-乙酰葡糖糖胺(N-acetylglucosamine)与2-DOS通过糖苷键相连，然后去乙酰酶BtrD催化2'-N-乙酰巴龙霉胺(2'-N-acetylparomamine)进行脱乙酰反应，形成巴龙霉胺[48](图3)。从目前研究结果不难发现，2-DOS氨基糖苷抗生素从葡萄糖-6-磷酸到2-DOS，再到拟二糖中间体巴龙霉胺这一生物合成途径在不同的氨基糖苷类抗生素中具有很强的通用性和保守性，自然界天然氨基糖苷终产物结构的多样性更多来源于后续丰富的基团修饰。

2.1 4,5-二取代型2-DOS氨基糖苷抗生素的生物合成

该类抗生素的结构特征是2-DOS环的C-4和C-5位羟基被取代，以糖苷键与糖环相连。以核糖霉素的生物合成途径为例，由2-DOS经BtrM和BtrD生成的拟二糖巴龙霉胺是该类抗生素生物合成途径中的重要前体，它通过脱氢酶BtrQ和转氨酶BtrB的依次作用，C-6'位的羟基转化为氨基，合成新霉胺(neamine)[49]，再通过磷酸核糖转移酶BtrL与磷酸酶BtrP的依次作用，其C-5位与核糖连接，生成核糖霉素[50]。而核糖霉素的C-3''位羟基通过脱氢酶BtrE和还原酶BtrF的连续作用，立体构型翻转，成为木糖菌素(xylostasin)[51]。值得注意的是，核糖的活化方式较为特殊，并非形成dNDP形式，而是形成磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)。核糖霉素和木糖菌素的2-DOS环N-1位点均可被4-氨基-2-羟基丁酰(4-amino-2-hydroxybutyric acid,AHBA)修饰，分别生成丁酰苷菌素的B和A组分。由于其优异的活性，AHBA早在20世纪70年代便成为人们通过化学半合成对天然氨基糖苷类抗生素进行修饰的重要侧链基团，以获得具有更好活性的氨基糖苷类抗生素衍生物。而AHBA的生物合成相关基因簇直到本世纪初才被揭示[50]，该基因簇包含7个基因：btrIbtrJ-btrK-btrO-btrV-btrH-btrG。Spencer研究组[52]在体外成功构建了一条包含5个关键酶：酰基载体蛋白BtrI、ATP-依赖型连接酶BtrJ、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate,PLP)依赖型脱羧酶BtrK、双组分黄素依赖型单加氧酶BtrO和BtrV，可合成AHBA侧链供体γ-L-Glu-AHBA-S-BtrI的生物合成途径。随后，他们又在体外完成了经酰基转移酶BtrH催化，将γ-L-Glu-AHBA-S-BtrI加载至核糖霉素拟三糖骨架上，并在一特殊的γ-谷氨酰环化转移酶的作用下脱去γ-谷氨酰生成丁酰苷菌素B[53]，最终揭示了丁酰苷菌素中AHBA侧链的生物合成与加载途径。在破解了AHBA的生物合成途径后，他们将化学合成的AHBA侧链供体的模拟底物γ-L-Glu-AHBA-SNAC，在上述BtrH与γ-谷氨酰环化转移酶的共同催化下，尝试加载至不同的天然氨基糖苷类抗生素上，并最终生成一些列具有“非天然”AHBA侧链的氨基糖苷类抗生素衍生物[54]。研究还发现BtrH在体外催化AHBA加载至其它2-DOS氨基糖苷类化合物上的过程中，表现出利用非天然底物γ-L-Glu-AHBA-SNAC较其天然底物γ-L-Glu-AHBA-S-BtrI更高的催化效率。

如果核糖霉素没有被AHBA修饰，而是经过糖基转移酶NeoF和去乙酰酶NeoD的催化，核糖环C-3''位与葡萄糖胺相连，则可生成拟四糖骨架[55]，它的C-6'位羟基经过脱氢酶NeoQ和转氨酶NeoB作用成为氨基[49]，即为新霉素C。值得一提的是，在新霉素系列产物合成过程中，NeoQ和NeoB分别是BtrQ和BtrB的同源蛋白，它们也负责C-6'位的氨基化[49]。而新霉素C的C-5'位立体构型经过NeoN催化后翻转，生成新霉素B。在此，NeoB仅识别C-5'为S构型底物，特异性强，而NeoN则是radical SAM依赖的差向异构酶[56]，其机理较为特殊，与常见的磷酸吡哆醛依赖型异构酶有明显差异。新霉素B有多种类似物，其中巴龙霉素与其之间差异在于C-6'位为羟基而非氨基，在其生物合成过程中，ParQ和ParB分别为NeoQ和NeoB的同源蛋白，但它们的功能却有差异，ParQ和ParB只能负责C-6'位氨基化，无法完成C-6'位的修饰[57]。利维霉素(lividomycin)B则在巴龙霉素的结构基础上，C-6'位构型翻转，此外它还缺失了C-3'位羟基，这可能源自脱水酶LivW和还原酶LivY所负责的脱氧[57]。另一方面，利维酶素A则比新霉素B多了一个甘露糖环结构，这一修饰可能源于某个糖基转移酶。

2.2 4,6-二取代型2-DOS氨基糖苷抗生素的生物合成

此类抗生素的结构特征是2-DOS环的C-4和C-6位羟基被取代，以糖苷键与糖环相连。卡那霉素(kanamycin)作为该家族的重要成员，其生物合成途径已被清晰阐明。根据Sohng研究组和Yong研究组[58]的报道，2-DOS母核合成后，首先在糖基转移酶KanF和去乙酰酶KacA的作用下生成巴龙霉胺，随后通过脱氢酶KanI和转氨酶KacL的催化生成新霉胺，这些反应与4,5-二取代型的合成相似，但此后反应差异明显。作为合成单元，UDP-葡萄糖在脱氢酶KanC和转氨酶KanD的作用下，转化为UDP-卡那糖胺(UDPkanosamine)，而糖基转移酶KanE将它连接至新霉胺的C-6位，生成卡那霉素B[58]，而Eguchi研究组的研究表明，在α-酮戊二酸依赖的非血红素铁氧化酶KanJ的作用下，卡那霉素B的C-2'位的氨基氧化为羰基，再由还原酶KanK加氢变为羟基，生成卡那霉素A[59]。在此过程中，KanI、KacL和KanE具有宽泛的底物识别能力，产生了多种结构差异的中间体，其中包括了C-6'位为羟基的卡那霉素C。

另一方面，负责在2-DOS上加载N-乙酰葡萄糖胺的糖基转移酶KanF还能以UDP-葡萄糖为底物，生成2'-去氨基-2'-羟基-巴龙霉胺(2'-deamino-2'-hydroxyparomamine)，它可作为后续一系列修饰的底物，最终转化为C-2'位为羟基的化合物，即卡那霉素A和卡那霉素X组分。而该含有2'-去氨基-2'-羟基-巴龙霉胺的分支途径，同样也由于KanI、KacL和KanE的相对独立及底物宽泛性，形成了复杂的交叉代谢网络[58]。 从结构的角度来说，妥布霉素(tobramycin)属于卡那霉素类似物，它与卡那霉素B的区别在于C-3'上的缺失了羟基，可以称为脱氧卡那霉素B。这种单脱氧结构与另一种氨基糖苷阿泊拉霉素(也称安普霉素,apramycin)相似，在生物合成上可能也有相似之处。

图4 庆大霉素C生物合成途径及其基因簇彩色标注的部分为甲基化合成步骤及其合成基因Fig.4 Gentamicin C biosynthetic pathway and its gene cluster methylation and its biosynthetic genes are highlighted in color

4,6-二取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素家族中另一重要成员是庆大霉素。它也以巴龙霉胺为合成前体，但加载第三个糖环并非葡萄糖环，而是吡喃型木糖环(图1)。异源表达的结果显示，它由糖基转移酶GenM2连接至2-DOS的C-6位，形成拟三糖骨架即庆大霉素中间体A2[60](图4)。随后，拟三糖骨架的C-3''位的羟基经过GenD2的脱氢和GenS2的转氨，生成DAA2，随后甲基转移酶GenN对其N-3''位进行甲基化修饰，生成中间体A，再由甲基转移酶GenD1对其C-4''位进行甲基化修饰，生成中间体X2[61]，而它也是引发形成庆大霉素C多组分的重要分支点。作为一个化学结构并不十分复杂的氨基糖苷分子，庆大霉素却存在着令人惊奇的、极其多样的甲基化修饰，这些甲基化修饰既是庆大霉素结构多样性和生物活性展示的重要功能基团，同时也是耐药性产生的关键结构单元。除前期洪文荣等和Liu研究组发现的由甲基转移酶GenK在C-6'位进行甲基化修饰生成G418[62-63]之外，孙宇辉研究组和Peter Leadlay研究组近期的研究结果揭示出甲基转移酶GenN、GenD1和GenK的作用的先后顺序并不严格，它们所催化的C-6'、N-3''和C-4''上的甲基化相对独立，突破了人们对庆大霉素甲基化“串联式”顺序依次发生的传统认识，首次建立了“并联式”多步甲基化修饰的立体网络模型[64](图4)。

值得注意的是，GenD1和GenK同属独特的radical SAM依赖型甲基转移酶，该家族蛋白使用[4Fe-4S]铁硫簇和维生素B12为辅因子，可对非活性的原子甲基化，而Huang等[61-65]利用底物类似物与GenK进行体外酶学实验，通过观察SAM的分解和产物的生成，对其催化机理进行了更深入的探索。

在庆大霉素所有的甲基化修饰中，N-6'位甲基化对于通过代谢途径定向阻断来获得依替米星(etimicin)化学半合成原料—庆大霉素C1a以及低毒性单一组分C2至关重要，但其编码基因却一直未曾找到，尽管庆大霉素生物合成基因簇中所有可能的甲基化基因都通过基因敲除被一一考察。最终，孙宇辉研究组和Peter Leadlay研究组[64]通过全基因组测序，并结合体外酶学和体内遗传等手段，成功定位了负责庆大霉素生物合成最后一步甲基化基因genL。出人意料的是，该基因在染色体上与庆大霉素生物合成基因簇远隔2.54Mb(图4)，这一结果也为庆大霉素甲基化修饰网络填补上了最后一个缺口。

庆大霉素中间体G418形成后，经过脱氢酶GenQ和转氨酶GenB1的作用，C-2'位被氨基化，生成JI-20B[66]。陈代杰研究组和刘文研究组[67]的实验结果表明，它经过GenP的催化，C-3'位被磷酸化形成Pi-JI-20B。根据推测，Pi-JI-20B经过3',4'-脱双羟基，生成威达米星(verdamicin)，再经过4',5'双键还原，生成庆大霉素C2a，这一系列修饰与PLP依赖的转氨酶GenB3和GenB4有关[66]。此后C2a在差向异构酶GenB2的作用下，C-6'位立体构型改变，成为庆大霉素C2[66]。2015年，夏焕章研究组指出，GenB2也能够催化JI-20B的C-6'位差向异构，生成epi-JI-20B。不仅如此，GenB2还可以完成JI-20B和epi-JI-20B的相互转化[68]。如果以上各修饰过程不以G418为底物，而是以与之对应但C-6'无甲基化修饰的X2为底物，则形成了另一条与之平行的代谢途径，被相同的酶依次催化，产生一系列C-6'位无甲基的同系物，即JI-20A(与JI-20B对应)，西索米星(与威达米星对应)，庆大霉素C1a(与C2a和C2对应)以及庆大霉素C2b(与C1对应)(图4)。通过阻断控制C-6'甲基化的GenK，可导致C1a和C2b所在代谢支路组分的大量积累[69-70]。但对于如何通过遗传手段仅获得另一代谢支路中的C2a、C2、C1各组分，仍将是一个巨大的挑战。

庆大霉素B组分源于庆大霉素C生物合成途径的另一分支，是庆大霉素产生菌的次要产物。在庆大霉素生物合成中，负责糖基加载的GenM1底物特异性较为宽泛，能以2-DOS和UDP-葡萄糖作为底物，生成卡那霉素中间体，即2'-去氨基-2'-羟基-巴龙霉胺，它可被下游的修饰酶催化，生成2'-去氨基-2'-羟基-JI-20A，即庆大霉素B[71]。此外，夏焕章研究组通过失活其染色体上负责磷酸化修饰的genP，阻断下游的脱双羟基和双键还原等修饰，并将负责C-2'位脱氨基和羟基化的kanJ和kanK导入庆大霉素产生菌，同样得到庆大霉素B[72]，而在喂养葡萄糖的情况下，过表达糖基转移酶KanM1和GenM2则有助于提升庆大霉素B和C1a的产量[73]。

2.3 单取代型2-DOS氨基糖苷抗生素的生物合成

单取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素的特征为2-DOS母核上仅连接了一个糖环取代基。阿泊拉霉素是该家族成员的代表，其生物合成也以巴龙霉胺为前体，但根据虞沂研究组和张琪研究组的研究，其C-6'位并未被氨基化，而是通过脱水酶AprD4催化C-3'位脱水，并由NADH/NADPH依赖的还原酶AprD3还原C-4'位的羰基，生成利维胺(lividamine)[74]，该结构可能也与妥布霉素和利维霉素B等含有C-3'位单脱氧糖环结构的氨基糖苷的合成相关。在此之后，利维胺经脱氢酶AprQ催化，在C-6'位羟基脱氢[74]，但如果该步骤发生在AprD4和AprD3负责的C-3'脱氧之前，则会形成C-6'位为羰基的副产物，导致C-3'脱氧无法进行[74]。Eguchi研究组则对AprD4和AprD3的底物选择性进行了探究，发现它们更倾向于C-6'为羟基而非氨基的底物[75]。 一般情况下，通过AprQ作用后，中间体经一系列催化，第二个糖环变为含并环的八碳糖环结构，随后加载第三个糖环，并进行甲基化等后修饰[76]，形成阿泊拉霉素。值得注意的是，AprD4是radical SAM依赖的脱水酶，在反应过程中形成自由基，机理较为特殊[77]。

在单取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素中，潮霉素(hygromycin)B的生物合成也始于2-DOS。根据孙宇辉研究组的研究报道，与上述使用葡萄糖环或其衍生物为第二个结构单元的化合物不同，它是在糖基转移酶HygF的作用下，以UDP-半乳糖为底物，将半乳糖环连接至2-DOS的C-5位[78]。而甲基转移酶HygM可将2-DOS的N-3位甲基化，该修饰可以发生在二糖形成前或形成后，并无严格顺序[78]。而潮霉素的第三个糖环为七碳糖，根据陈义华研究组的报道，它源自景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose-7-phosphate)。首先，异构酶HygP将它异构形成环状的D-甘油醛-β-阿卓-庚糖(D-glycero-β-D-altro-heptose)，再通过如磷酸转移酶HygN、磷酸酶HygU和NDP-七碳糖合酶HygO等酶催化，活化形成ADP-甘油醛-β-阿卓-庚糖，该化合物或其修饰后的产物可能是第三个糖环的直接来源[79]。潮霉素B的生物合成过程还包括氧化、转氨和差向异构等修饰，其中尤为独特的是第二和第三个糖环之间形成的螺环结构，这一步骤是由α-酮戊二酸依赖的非血红素铁氧化酶HygX实现的，它将羟基的氧原子与C-1''碳相连，而该反应同样不依赖N-1位甲基化与否[78-80]。越霉素(destomycin)B是潮霉素B的类似物，它们的区别仅在于越霉素B的C-4''位立体构型与潮霉素B不同，两者的生物合成路径可能也非常相似。

另一个单取代型2-DOS型氨基糖苷抗生素的代表为依他霉素(istamycin)A，它也以单脱氧的氨基环醇为母核，但氨基取代的位置，以及一些碳原子的立体构型与2-DOS不同。而依他霉素A的第二个糖环与庆大霉素C2b完全相同，它们在生物合成上可能存在相似之处[29]。该类型的氨基糖苷抗生素还包括dactimicin，sannamycin B和依他霉素B等，它们与依他霉素A的区别在于对母核的后修饰，dactimicin在C-6'位有甲基化修饰，与庆大霉素C1相似，sannamycin B母核的N-1位缺失了氨乙酰化修饰，而依他霉素B的C-3位立体构型发生了翻转。

3 化学半合成氨基糖苷抗生素的替代生物合成

除天然来源的第一代氨基糖苷类抗生素外，人们亦通过化学半合成创造出更多结构多样性的第二代氨基糖苷类抗生素来满足人们对更高活性、更小副作用，特别是应对逐渐出现的耐药性的需求。多种经化学半合成的氨基糖苷类抗生素已成功应用于临床，例如通过化学方法将卡那霉素B的C-3'，C-4'羟基脱去，产生卡那霉素衍生物地贝卡星(dibekacin)[81]；通过化学方法将AHBA基团引入卡那霉素母核产生阿米卡星(amikacin)[82]；在阿米卡星的基础之上将其C-3'和C-4'羟基脱去，产生阿贝卡星(arbekacin)[83]；将庆大霉素母核上的氨基基团利用化学方法进行烷基化修饰，产生奈替米星(netilmicin)[84]和依替米星[85]；利用类似的方法将庆大霉素B的母核上1-N引入AHBA基团产生异帕米星(isepamicin)[86](图1)。

尽管通过化学半合成氨基糖苷类抗生素取得了长足的进展，但存在合成步骤繁琐、产率低、环保压力大等问题。随着合成生物学等技术的突飞猛进，人们越来越多开始思考利用生物合成的方法来取代原本通过化学半合成获得的氨基糖苷类抗生素，这也将成为合成下一代氨基糖苷类抗生素新的突破口。例如plazomicin是以西索米星为基本骨架，经多步化学修饰在N-1位加载AHBA侧链，并在N-6'位进行羟乙基修饰而获得[87]。而AHBA侧链在丁酰苷菌素中天然存在，对于含该侧链的半合成抗生素，可望利用合成生物学的方法，将AHBA侧链生物合成途径引入西索米星产生菌，运用生物发酵的方法来生产原本需要通过多步化学半合成才能获得的plazomicin。为了实现这一愿景，人们已开始了探索和尝试。如2011年，Park等[58]首次将丁酰苷菌素产生菌中负责AHBA侧链生物合成与加载所需的7个基因btrI-btrJ-btrK-btrO-btrV-btrH-btrG与卡那霉素生物合成最小基因簇进行融合，并在委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)中实现了异源表达，在产物中检测到含有AHBA侧链的阿米卡星和1-N-AHBA-卡那霉素X，尽管最终转化率不足10%，而且负责羟乙基修饰的酶在氨基糖苷类的生物合成中也尚未有报道，这也是实现plazomicin全生物合成需要面临和克服的另一个挑战，但这证实了利用生物合成替代化学半合成这一思路的可行性。

4 氨基糖苷生物合成酶的结构研究

分子遗传学、生物化学及化学生物学方法的应用，大大推动了氨基糖苷抗生素的生物合成研究，而结构生物学的进展，则从更深层次的角度揭示了相关酶的微观特征及其催化机制。Eguchi研究组[88]于2007年解析了丁酰苷菌素生物合成中负责2-DOS母核结构合成的第一个酶，即NAD+/NADP+依赖的2-DOI合酶BtrC的晶体结构，它为非对称二聚体，且具有两个不同的活性位点，并与Co2+结合，该研究阐明了BtrC的催化机理。

在氨基糖苷的生物合成中，涉及到很多PLP依赖的酶。Spencer研究组[89]揭示了在丁酰苷菌素2-DOS生物合成中负责两步转氨反应的BtrR，确定其属于天冬氨酸转氨酶类，获得了它与辅因子PLP/PMP(pyridoxamine phosphate,PMP)结合后的晶体结构，通过分析其结构差异，推测了对底物识别的影响。他们还研究了同为PLP依赖酶的BtrK，它在AHBA侧链的合成中执行脱羧功能，在其递交的结构数据中可见酶与PLP结合的活性中心。而Holden研究组[90]则通过对该蛋白与来自于核糖霉素生物合成途径的同源蛋白RbmB的结构对比，分析了两者在结合2-DOS底物后的外亚胺状态下的空间结构的异同。该研究组还通过X-射线晶体衍射技术，获得了新霉素合成中PLP依赖的转氨酶NeoB的结构信息。该酶能催化C-6'和C-6'两个位点的转氨，而该研究揭示了它与不同底物结合的状态和活性位点，并与庆大霉素生物合成中的C-6'转氨酶GenB1进行了对比[91]。2019年，Ban等[71]对GenB1的结构经历了进行了更细致的考察，揭示了其中的甲基口袋对于底物识别和结合效率的影响。

对于庆大霉素生物合成中的关键酶，Dias研究组[92]解析了其中甲基转移酶GenN的晶体结构，确证了它对多种底物的甲基化活性，并通过对其三维结构的分析，阐释了这种底物宽泛性的来源。该研究组还解析了庆大霉素合成中另一个关键酶GenD2的结构信息，GenD2是NAD+/NADP+依赖的氧化还原酶，负责C-3''羟基的脱氢，通过结构分析确认了其中两处特殊的β-折叠，并分析了它对二聚体形成及底物识别的影响[93]。

McCulloch等[80]推测HygX为氧化酶，可能负责潮霉素B生物合成中最后一步成环反应，并获取了它与潮霉素B的共结晶，虽然该结果中以镍离子代替了实际发挥作用的铁离子，并测定了它与潮霉素B的底物亲和性。作者据此推测了HygX的催化氧化环化反应的机理，并比较了它与其它α-酮戊二酸依赖的非血红素铁氧化酶在结构上的异同。

近年来，radical SAM依赖酶在天然产物中的作用逐步成为研究的难点和热点，该家族蛋白往往对氧极为敏感，且在体外往往需要进行铁硫簇重组才具有活性，对实验条件要求较高，这可能是其早期研究并不充分的原因之一。2007年，Eguchi研究组[42]解析了丁酰苷菌素生物合成途径中脱氢酶BtrN与底物与SAM的共结晶，其折叠方式与已知模型有明显差异。研究结果还显示，除了催化SAM裂解的铁硫簇之外，该酶还结合了一个辅助铁硫簇，而根据它与底物的相对位置分析及与同类蛋白的对比，它可能与氧化还原的催化过程紧密相关。Nicolet研究组和张琪研究组测定了阿泊拉霉素生物合成途径中脱水酶AprD4的结构，结果显示它仅有一个铁硫簇，通过对底物共结晶的分析，指出了底物构象对于催化的影响，并阐明了与该反应配套的质子传递链[77]。

5 总结与展望

综上所述，来自分子遗传学、生物化学和结构生物学的国内外研究进展使氨基糖苷类抗生素生物合成途径和机制正逐渐清晰，这不仅有助于彻底解答困扰已久的重要基础科学问题，也为人们利用合成生物学方法进行定向优化和理性创制第三代新型氨基糖苷类抗生素提供了必要前提。但截至目前，仍有一些关键的生物合成机制问题还有待揭示，如作为氨基糖苷类抗生素经典代表的庆大霉素，目前关于其绛红糖胺(purpurosamine)结构上3',4'-脱双羟基和4',5'-双键还原机制依然是一个未解之谜，它不仅直接关乎庆大霉素重要代谢中间产物西索米星的生物合成，更是庆大霉素完整生物合成线路图中不可或缺的最后一块神秘“拼图”。再如阿泊拉霉素中八碳糖结构单元的合成和并环过程、潮霉素B中C-2'位的差向异构，以及福提霉素和依他霉素的母核合成路径等问题。另外，目前仍有许多功能已知但结构未知的蛋白，尤其是radical SAM依赖的酶，其生成自由基的独特机理以及对非活泼碳原子的修饰机制备受关注。目前已获得的蛋白结构数据有限，多是基于X-射线晶体衍射技术，但该技术对蛋白晶体的质量要求较高，而新兴的冷冻电镜技术或许有助于难以获得结晶的蛋白的结构解析。可以预见，随着结构生物学技术的发展，氨基糖苷类抗生素生物合成途径中更多蛋白的结构和功能将被揭示，从而加深人们对这一种重要类别抗生素生物合成机理的认知和利用。