诃子对低密度脂蛋白所含蛋白apoB100氧化修饰抑制效果的研究

,4,4,*

(1.九江学院药学与生命科学学院,江西九江 332000;2.江西中医药大学药学系,江西南昌 330004;3.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;4.六盘水师范学院生物科学与技术学院,六盘水特色果树资源研究与利用重点实验室,贵州六盘水 553004)

诃子(TerminaliachebulaRetz,TCR)为使君子科榄仁树属植物诃子及其变种绒毛诃子的成熟干燥果实,具有降血糖、抗诱变、防治肝脏疾病、抗癌及抗氧化等多种功效[1],在藏药中有“药中之王”的美誉[2]。

低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)是平均直径22 nm、密度1.019～1.063 g/mL左右的颗粒,由约80%脂类及单一蛋白apoB100(约占20%)组成[3-4]。LDL为人类血液循环中胆固醇的主要运输载体,是胆固醇转移和新陈代谢的关键物质[3]。LDL所含脂类及蛋白均容易被过渡金属离子、自由基等物质所氧化[3,5]。LDL氧化是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)形成的关键因素[6],而AS是引起心血管疾病和脑梗塞的最主要原因[7]。在特定生理条件下,LDL所含的脂类及蛋白组分均易被氧化而导致其生化及荧光特性发生改变,可通过监测这些特性的变化反映被氧化修饰程度[5,8-9]。

荧光光谱具有高灵敏度、选择性和多功能性等优势,被广泛运用于各种蛋白荧光特性的表征[8]。三维荧光扫描则可直观显示样品在一定发射和激发波长范围内的荧光变化情况,该变化可通过三维荧光等高线光谱图显示出来[8]。

LDL所含脂类氧化产生的醛类(如MDA)[10]会导致Lys上的游离氨基活性降低[8],在340 nm处测定OD值的变化可反映Lys游离氨基活性衰减程度[5]。除了脂类易发生氧化以外,LDL所含蛋白apoB100也容易发生氧化反应,导致其荧光发生相应变化(如色氨酸(Trp)荧光猝灭[8]、总荧光产物及脂褐素含量增加等)[8,11]。Israni等[12]发现诃子水提物能有效降低高血脂大鼠体内低密度脂蛋白含量。

本实验室前期研究表明,诃子在国家公布的114种可用于保健食品原料中抗氧化活性高居第一[13];刘仁绿等[14]进一步发现,诃子粗提物(the crude extracts of Terminalia chebula Retz,CET)对LDL所含脂类成分在氧化过程中TBARS的产生具有显著的抑制作用,且不同极性部位抑制作用差异明显,乙酸乙酯相为其有效部位。但是,诃子对LDL所含蛋白成分(apoB100)氧化的抑制能力及其抑制LDL蛋白组分氧化过程荧光特性改变的功效目前均不清楚。

因此,在实验室前期研究诃子抗氧化、抑制LDL脂类成分氧化的工作基础上,本文采用荧光光谱学技术进一步检测TCR抑制LDL所含蛋白氧化的抑制效果,以期为后续相关功能食品研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

诃子 产地广西,购自湖南长沙君昊中药饮片科贸有限公司,买回后立即粉碎干燥、过50目筛后置入冰箱中备用;LDL从健康人体血浆中分离得到;肝素钠(185 U/mg) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS) 成都格雷西亚化学技术有限公司;其它试剂 均为国产分析纯或优级纯。

LS-55荧光/磷光/发光分光光度计 美国Perkin Elmer公司;PB-10型pH计 Sartorius仪器设备有限公司;DFY-C型高速粉碎机 温岭林大机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 诃子粗提物及乙酸乙酯相制备 根据江慎华等[1]采用的生物活性追踪法制备得到诃子粗提物及乙酸乙酯相(the ethyl acetate fraction of Terminalia chebula Retz,EAFT)。称取160 g诃子干粉,采用50%乙醇、料液比1∶20 (g∶mL)、60 ℃提取4次,每次提取7 min,最后将提取液合并。取1/10作为粗提液,浓缩、冻干后得到CET。剩余9/10提取液浓缩后加入一定体积的蒸馏水制成悬浊液,分别采用极性逐渐增大的正己烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,最后剩余水相部位。其中,乙酸乙酯萃取液浓缩、冻干后得到EAFT,采用甲醇配制成不同浓度样液备用。

1.2.2 LDL制备 采用刘仁绿[14]、Wieland等[15]和Yang等[5]方法。取血浆300 mL,加入沉淀液3000 mL(肝素钠浓度50000 U/L,0.064 mol/L柠檬酸三钠,5 mol/L盐酸调pH至5.04),混合均匀,磁力搅拌30 s,37 ℃水浴15 min后于4 ℃、3000 r/min离心10 min,弃上清液获得沉淀物,向沉淀中加入1500 mL洗涤液(0.064 mol/L柠檬酸钠,pH=5.11)溶解洗涤后于4 ℃、3000 r/min离心10 min,所得沉淀用160 g/L NaCl、8.1 mol/L Na2HPO4·12H2O、1.5 mol/L KH2PO4、2.7 mol/L KCl、pH7.4的高盐磷酸盐缓冲液将上述沉淀溶解,冰箱中避光透析24 h,每6 h换一次透析液。以牛血清白蛋白为标准品,采用Lowry法测定蛋白浓度来表示LDL浓度,所需各种LDL浓度用高盐PBS稀释、4 ℃避光保存并3 d内用完。

1.2.3 诃子对LDL中apoB100氧化修饰的抑制效果 空白指未添加氧化剂CuSO4,分别以相同体积去离子水和甲醇代替CuSO4和诃子样液;促氧指添加氧化剂CuSO4,以相同体积甲醇代替诃子样液;阳性对照指以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-Tert-Butyl-4-Methylphenol,BHT)来代替诃子样液,以上样品其它操作均相同。以下各浓度均为混合体系中的终浓度。

1.2.3.1 对apoB100中Lys游离氨基活性降低的抑制效果 定量测定抑制效果:运用TNBS活性法[16],略作修改。取浓度750 μg/mL的LDL 9.8 mL,加 0.1 mL CuSO4或者去离子水,再加0.1 mL不同浓度样液(样液浓度分别为1.25、2.5、5 μg/mL)或甲醇,37 ℃恒温孵育氧化24 h后,取1 mL体系混合液与1 mL 4% NaCHCO3混匀,加50 μL 0.1% TNBS溶液,37 ℃孵育1 h后在340 nm处测定吸光度值。

采用此方法对CET及EAFT的抑制效果进行测定。

定性测定抑制效果:按照Picard等[17]和Yang等[5]方法,分别固定激发波长Ex 350 nm、扫描发射波长范围Em 400～550 nm和固定激发波长Ex 390 nm、扫描发射波长范围Em 400～550 nm来扫描LDL在氧化过程中产生的活性醛及MDA修饰Lys残基荧光变化情况。

1.2.3.2 对LDL中apoB100中色氨酸(Trp)荧光猝灭的抑制效果 定量测定抑制效果:采用Chen 等[18]方法,略作修改。取4.9 mL 500 μg/mL LDL溶液,加50 μL 1.25 μmol/L CuSO4或去离子水,再加50 μL不同浓度样液(样液浓度分别为5、10、15 μg/mL)或甲醇,37 ℃恒温水浴孵育氧化18 h后在Ex295/Em330 nm测定荧光强度。

定性测定抑制效果:采用Yang等[5]方法,略作修改。按照上述1.2.3.1的方法孵育,固定激发波长(Ex)280 nm,扫描发射波长(Em)(300～450) nm来扫描LDL氧化过程中Trp荧光猝灭的效果。

1.2.3.3 对apoB100在氧化过程中总荧光产生的抑制效果 采用Yang等[5]方法,按照1.2.3.1方法孵育反应体系,在Ex360/Em 430 nm处测定荧光强度以评价抑制效果。

1.2.3.4 对apoB100在氧化过程中脂褐素产生的抑制效果 采用Yang等[5]、谢志勇等[19]方法,按照1.2.3.1方法孵育反应体系,在Ex350/Em 460 nm处测定LDL氧化产生脂褐素的荧光强度。

1.2.3.5 对apoB100在氧化过程中三维荧光产生的抑制效果 运用曾钧杰等[8]和Mclean等[20]方法,按照1.2.3.1(1)方法孵育反应体系,设定Ex(200～420 nm)、Em(260～500 nm)狭缝宽度均为15 nm及光谱间隔10 nm进行三维荧光扫描,获得三维荧光等高线图来评价EAFT对apoB100氧化过程中荧光变化的抑制效果。

1.3 数据处理

所有相关试验及测定均进行3次重复,采用DPS数据分析软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 CET对apoB100中Lys游离氨基活性降低的抑制效果

为了验证诃子对LDL氧化过程中apoB100荧光改变的抑制效果,本文首先对CET的抑制作用进行了测定与分析。Lys游离氨基与TNBS反应形成的复合物在340 nm处有吸收,通过测定Lys氨基活性程度可反映出LDL氧化修饰程度,吸光度值越高表示氧化程度越低[16]。本文首先采用1.2.3.1方法测得CET对apoB100氧化修饰的抑制效果如图1所示。从图1可看出,当CET浓度为1.25和2.5 μg/mL时,OD340值分别为0.228和0.319,分别比促氧组(OD340值为0.216)高出5.56%、47.69%,与同浓度的BHT组相比略低,但均显著大于促氧组(P<0.05)。而当CET浓度为5 μg/mL时,OD340值甚至显著大于空白组(OD340值为0.393)(P<0.05),表明CET能显著抑制LDL所含蛋白组分氧化,这可能是由于粗提物中所含的有效成分能够保护Lys残基不受氧化修饰。实验室前期研究也发现丁香粗提物中有效成分也能保护Lys残基不被氧化修饰[8]。

图1 CET对赖氨酸游离氨基酸活性降低的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of CETon reactivity decrease of free amino in Lysine注:图中不同小写字母表示各样品抑制效果具有显著性差异(P<0.05);图2、图5同。

上述测定结果表明,CET对apoB100氧化过程具有很强的抑制效果。实验室前期研究发现,EAFT在诃子不同极性部位(正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相)中抗氧化能力最强,为其抗氧化有效部位[13];同时又发现EAFT对LDL所含脂类氧化具有显著的抑制效果[14]。因此,本文在此基础上进一步采用荧光技术对EAFT抑制LDL所含蛋白apoB100的氧化效果进行了分析与测定。

2.2 EAFT对LDL所含蛋白(apoB100)氧化修饰的抑制作用

2.2.1 EAFT对apoB100中Lys游离氨基活性降低的抑制效果

2.1.2.1 抑制效果定量测定 LDL中脂质组分发生氧化时产生大量包括活性醛(如MDA)在内的过氧化物,这些活性醛都会与LDL上所含Lys残基结合导致活性降低并最终形成[5]动脉粥样硬化[4]。通过测定Lys氨基活性程度可反映出LDL氧化修饰程度[16]。

按照1.2.3.1方法测定EAFT对LDL氧化过程中Lys游离氨基活性的测定结果如图2所示。从图2可看出,EAFT在1.25～5.0 μg/mL浓度范围内,对LDL氧化过程中的Lys游离氨基减少具有很强的抑制效果。随着浓度升高、抑制效果更强。尽管其抑制效果均弱于阳性对照BHT,但当浓度达2.5 μg/mL以上,其Lys游离氨基的活性显著高于空白组(P<0.05),这充分表明EAFT能有效抑制LDL氧化过程中Lys氧化修饰。

图2 EAFT对Lys游离氨基酸活性降低的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of EAFTon in reactivity decrease of free amino in Lysine

2.1.2.2 抑制效果定性测定 LDL脂质组分氧化产生的活性醛及MDA与LDL上所含Lys残基结合形成的希夫碱分别在Ex 350 nm/Em 420 nm、Ex 390 nm/Em 460 nm有很强的荧光吸收,荧光强度越强表示氧化程度越高。由此采用荧光扫描光谱可衡量样液对LDL脂质氧化产物活性醛对apoB100中Lys残基的氧化修饰程度[17],测得结果如图3～图4所示。

从图3、图4可知,促氧组荧光强度最高,空白组荧光强度最低,表示LDL中脂质过氧化产生的活性醛与Lys残基结合,增强了荧光吸收。当添加不同浓度样液后,荧光强度随EAFT浓度升高而降低,说明EAFT能很好地抑制LDL氧化过程中产生的活性醛修饰Lys残基。Picard等[17]也发现氨基胍能抑制活性醛和MDA修饰apoB100所含的Lys残基。

图3 EAFT对活性醛修饰Lys残基荧光改变的抑制Fig.3 Inhibition effect of EAFT on fluorescence spectrachange of Lys residue modified by reactive aldehydesa:促氧;b:1.25 μg/mL EAFT;c:2.5 μg/mL EAFT;d:5 μg/mL EAFT;e:BHT;f:空白。

图4 EAFT对MDA修饰Lys残基荧光改变的抑制Fig.4 Inhibition effect of EAFT on fluorescencespectra change of Lys residue modified by MDA注:a:促氧;b:1.25 μg/mL EAFT;c:2.5 μg/mL EAFT;d:5 μg/mL EAFT;e:BHT;f:空白。

2.2.2 EAFT对LDL所含apoB100中Trp氧化修饰的抑制作用 apoB100内所含的Trp在Cu2+介导作用下,在氧化延迟阶段易被氧化修饰、导致Trp残基减少[5]。而Trp是LDL主要的内在荧光团,当LDL被氧化后其荧光会发生猝灭,通过测定Trp荧光猝灭程度可反映LDL被氧化修饰程度,荧光强度越强表示氧化程度越低[21]。

2.2.2.1 定量测定对Trp荧光猝灭的抑制效果 采用1.2.3.1方法孵育反应体系测定结果如图5所示。从该图可看出,当EAFT浓度为5、10、15 μg/mL时,荧光强度分别为180.67、187.79、197.65,荧光强度与EAFT浓度呈正相关,而促氧组荧光强度仅为133.15,显著小于添加EAFT的样品组(P<0.05),表明EAFT能很好抑制Trp残基荧光猝灭、可有效防止LDL氧化。曾钧杰等[8]发现丁香中含有多酚,能够清除自由基、螯合过度金属离子,从而抑制Trp荧光猝灭。孟和阿木古浪等[22]也发现诃子中含有大量多酚类物质。因此,诃子可能也是通过其高含量的多酚类化合物实现对Trp荧光猝灭的抑制功效。

图5 定量测定EAFT对Trp荧光淬灭的抑制效果Fig.5 Inhibition effect of EAFTon Trp fluorescence quenching by quantitative determination

2.2.2.2 定性测定对Trp荧光猝灭的抑制效果 为了更直观地验证EAFT的抑制效果,本实验在2.1.1(1)基础上在Ex280 nm处激发、发射波长范围300～450 nm条件下进行荧光扫描,其结果如图6所示。从该图可看出,所有样品均在340 nm处有最大荧光吸收。与促氧组相比,空白组、BHT组和EAFT各浓度在340 nm处荧光吸收强度均更高、且与浓度成正比关系,与上图5中所测结果相一致。万严等[21]也发现丁香乙酸乙酯相也能有效抑制LDL氧化过程中Trp降解。

图6 定性测定EAFT对Trp荧光淬灭的抑制效果Fig.6 Inhibition effect of EAFTon Trp fluorescence quenching by qualitative determination注:a:促氧,b:15 μg/mLBHT,c:10 μg/mL BHT,d:5 μg/mL BHT,e:15 μg/mL EAFT,f:10 μg/mL EAFT,g:5 μg/ml EAFT,h:空白。

2.2.3 EAFT对LDL中apoB100在氧化过程中总荧光产生的抑制效果 据报道,天然LDL(native LDL,n-LDL)在Ex 360/Em430 nm处有微弱荧光吸收[5]。当LDL被氧化修饰后会形成在Ex360/Em 430 nm处有强荧光吸收的总荧光物质[8],荧光强度越强表示氧化程度越高[23]。在上述测定基础上,进一步对EAFT抑制总荧光产物产生的效果进行了检测。

按照上述1.2.3.3方法测定各样品总荧光产物的结果如图7所示。从该图可知,促氧荧光强度最高。添加不同浓度(5～15 μg/mL)EAFT样液后,尽管高于相同浓度的BHT,但与促氧样品的荧光强度(189.39)相比,其总荧光强度分别降低了48.88%、49.85%及59.15%,均极显著低于促氧(P<0.01),表明EAFT能有效抑制LDL氧化过程中总荧光产物的生成。Yang等[5]也发现丁香中乙酸乙酯相也能很好地抑制LDL氧化过程中总荧光产物的生成。Mclean等[20]也发现普罗布考(一种合成药)能减缓ox-LDL荧光产物的增加速率。

表1 EAFT对LDL三维荧光光谱改变的抑制效果Table 1 Inhibition effect of EAFT on the change of three-dimensional fluorescence contour spectroscopy during LDL oxidation

图7 EAFT对总荧光产物产生的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of EAFTon production oftotal fluorescence注:图中不同小写字母表示各样品抑制效果具有显著性差异(P<0.05);图8同。

2.2.4 EAFT对LDL中apoB100在氧化过程中脂褐素产生的抑制效果 脂褐素是人体内衰老的指标,通过测量脂褐素的含量可反映出细胞被自由基损伤的程度[8]。在LDL氧化期间也生成脂褐素。因此,在测定对总荧光产物抑制的基础上,本试验进一步对EAFT抑制脂褐素的产生效果进行了测定。

按照上述1.2.3.3方法测得结果如图8所示。从图中可知,促氧组荧光强度(137.55)最高、脂褐素产生量最多,比空白组荧光强度(46.915)高出了193.1%。添加不同浓度EAFT样液(5、10、15 μg/mL)后,荧光强度及脂褐素含量虽均高于BHT组但均显著低于促氧组(P<0.01),且样液浓度越高、脂褐素产生量越低,表明EAFT对LDL氧化过程中脂褐素的生成具有显著抑制作用(P<0.01),进一步验证明了其对LDL氧化的抑制效果。王丽丽等[10]也发现丁香叶提取物也能抑制脂褐素生成。

图8 EAFT对脂褐素产生的抑制效果Fig.8 Inhibition effect of EAFT on production oflipofuscins

2.2.5 EAFT对LDL中apoB100氧化过程中三维荧光光谱改变的抑制效果 在上述采用传统荧光技术发现EAFT对LDL所含蛋白氧化均有较好抑制效果的基础上,本文进一步采用三维荧光等高线谱直观表征其抑制效果,结果如图9及表1所示。其中,Peak A(Ex340/Em280 nm)处荧光强度表示天然LDL原始荧光信号,为Trp内源吸收峰[10],其信号越强代表氧化程度越低。而Peak B(Ex440/Em360 nm)处荧光强度表示LDL经氧化生成的新荧光产物,其信号越强代表氧化程度越高[8,24]。

从图9(a)及表1可知,空白组Peak A处荧光强度最高(990),LDL原始荧光信号完整,表示LDL未被氧化修饰[19]。当n-LDL被氧化成ox-LDL后(图9(b)),Peak A处荧光信号由n-LDL的990降低到ox-LDL的256.97,Peak B处新生成的荧光产物从n-LDL的73.55增加到ox-LDL的256.97。从图9(d)～图9(f)可知,当添加不同浓度的EAFT(5、10及15 μg/mL)样液后,与ox-LDL相比,Peak A处的荧光强度减弱程度得到有效抑制,其强度从ox-LDL的256.97分别增加到426.83、513.95、及538.6(图9、表1);而Peak B处荧光产物的生成也受到显著抑制,其强度从ox-LDL的256.97分别降低到130.01、138.64及128.23,进一步直观地表明了EAFT能有效抑制LDL氧化修饰。曾钧杰等[8]、张小霞等[24]也发现丁香乙酸乙酯相能有效抑制LDL氧化修饰,与本试验结果类似。

3 结论

本文首先发现诃子粗提物CET能有效抑制LDL所含蛋白apoB100中Lys游离氨基活性降低,体现出CET对LDL所含蛋白氧化的抑制效果。在此基础上,本实验进一步发现诃子抗氧化有效部位EAFT能有效抑制LDL所含蛋白apoB 100Trp荧光淬灭、总荧光产物及脂褐素的产生,也能抑制LDL氧化过程中三维荧光光谱的改变,抑制效果均呈现出较好的量效关系。本文结果为后续对EAFT组成成分分析及所含各种有效成分分离纯化提供参考。