真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷及其抗氧化和抑菌活性研究

李德海1,朱晓冉1,王 路2,*,王振宇2,赵楠楠1,龚金华

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040;2.哈尔滨工业大学化工与化学学院,黑龙江哈尔滨 150090;3.香港教育大学博文及社会科学学院科学与环境学系,香港 999077)

龙牙楤木(Araliaelata)别称辽东楤木、刺老芽、虎阳刺等,是五加科楤木属的多年生落叶灌木,主要分布于亚洲和北美洲,在我国主要分布于黑龙江东北部、吉林中部以及辽宁东北部等地区[1]。龙牙楤木全柱可入药,味苦、辛,性平,具有活血化瘀、补气安神、强精滋肾、除湿止痛之功效,可用于治疗风湿性关节炎、神经衰弱、肝炎、糖尿病及肿瘤等。龙牙楤木营养丰富,含有碳水化合物、氨基酸、矿物质、维生素等营养物质以及皂苷、多糖、多酚等多种活性成分,有“山野菜之王”的美誉。皂苷类化合物广泛存在于楤木属植物中,是龙牙楤木主要药效成分,从龙牙楤木根、茎、叶、嫩枝等部位共分离鉴定出100余种皂苷。皂苷具有抑菌、抗炎、降血脂、保肝、抗癌和防治糖尿病、调节心脑血管系统等多种生物功能[2-5],可用于医药和功能食品等领域,具有广泛的开发应用前景。

目前对龙牙楤木皂苷的提取多采用热回流、微波、超声波[6]、闪式提取法[7]等辅助方法,单一方法存在着用时长、能耗高、提取不完全等缺点[8],因此本试验将超声波技术和真空技术结合起来提取龙牙楤木皂苷,超声波因其热效应、空化效应和机械剪切效应能够迅速破坏细胞结构,加速活性物质的扩散溶解而应用广泛,而真空条件下降低了热敏性物质随温度升高造成的氧化和降解,且使体系沸点降低,提取液更加活跃,从而加快提取速率[9]。

本试验以龙牙楤木为试验原料,乙醇溶液为提取溶剂,在单因素实验的基础上,利用响应面法优化了真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷的工艺,并将真空耦合超声波制备的龙牙楤木皂苷与常压超声、溶剂提取条件下制备的龙牙楤木皂苷的抗氧化活性和抑菌活性进行对比分析,为龙牙楤木这一药食同源性木本植物更好的开发利用、更全面地发挥其药用价值和经济价值提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜龙牙楤木样品全柱 采自辽宁省丹东市,经哈尔滨工业大学王振宇教授鉴定为五加科植物龙牙楤木(Araliaelata);大肠杆菌EscherichiacoliATCC25922、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaurousRosen Bach ATCC6538、枯草芽孢杆菌BacillusSubtilisATCC6633 上海艾研生物科技有限公司;齐墩果酸标准品(批号508-02-1,纯度≥98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美国Sigma公司;D101大孔树脂 国药集团化学试剂有限公司;香草醛、冰醋酸、抗坏血酸、无水乙醇等其它试剂均为分析纯 上海源叶生物科技有限公司。

SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;RT-6000酶标仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司;KQ-700GVDV型三频恒温数控超声波清洗器 江苏省昆山市超声波仪器有限公司;DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;BHC-1300IIA2 超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司;LGJ-25C 型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 龙牙楤木新鲜样品40 ℃烘48 h后粉碎过60目筛,按1∶20料液比加入30～60 ℃石油醚脱脂脱色6 h,过滤,滤渣通风橱自然挥干溶剂后于4 ℃保藏备用。

1.2.2 真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷的单因素实验 准确称取预处理的龙牙楤木2.00 g于烧瓶内,按一定的料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)加入一定的体积分数(20%、40%、60%、80%、100%)的乙醇溶液,按照图1连接好提取设备,开启真空泵形成负压,通过三通阀调节真空度(0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa),使提取液保持微沸,同时启动超声仪器,在超声温度(20、30、40、50、60、70 ℃)和超声功率(150、180、210、240、270、300 W)条件下提取一定时间(30、40、50、60、70 min),离心定容得龙牙楤木皂苷提取液。料液比、乙醇体积分数、真空度、超声温度、超声功率和超声时间的固定水平分别为1∶25 g/mL、60%、0.06 MPa、60 ℃、210 W、30 min,在对各因素进行单因素试验探究时,其他因素均取固定水平。

图1 真空超声波设备连接图Fig.1 Schematic representation of the experimental setupused for ultrasonic-vacuum assisted extraction

1.2.3 Plackett-Burman试验设计联用Box-Behnken响应面法优化提取工艺 在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman试验确定对龙牙楤木皂苷提取得率影响显著的因素,采用中心组合Box-Benhnken Design(BBD)设计试验进行响应面优化真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷工艺[10]。筛出显著因素进行响应面中心组合试验,响应面试验设计表见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计Table 1 Box-Behnken design test factor and level design

1.2.4 龙牙楤木皂苷得率的测定 采用香草醛-冰醋酸-紫外分光光度法[12],以齐墩果酸标准溶液质量浓度为横坐标,溶液吸光度为纵坐标,得到标准曲线为y=6.9129x-0.00788,R2=0.9993

式中:C为提取液中皂苷浓度,mg/mL;N为稀释倍数,V为提取液体积,mL;M为原料质量,g。

1.2.5 不同提取方法的比较 试验课题组采用响应面优化了真空耦合超声波、常压超声、溶剂提取法提取龙牙楤木皂苷的工艺,真空耦合超声波最佳提取工艺为:液料比1∶24.8 g/mL、乙醇体积分数80%、超声温度57.7 ℃、超声功率273 W、超声时间50 min、真空度0.0787 MPa。常压超声最佳提取工艺为:液料比1∶25 g/mL、乙醇体积分数82.95%、超声温度82.62 ℃、超声功率300 W、超声时间78.88 min。溶剂提取法最佳提取工艺为:液料比1∶29.85 g/mL、乙醇体积分数81.65%、提取温度83.95 ℃、提取时间120 min。考虑到实际操作可能性,对三种提取方法最佳提取条件略作调整后进行响应面验证试验,真空耦合超声波法工艺参数调整为:料液比1∶25 g/mL、乙醇体积分数80%、超声温度58 ℃、超声功率270 W、超声时间50 min、真空度0.08 MPa,常压超声法工艺参数调整为:液料比1∶25 g/mL、乙醇体积分数83%、超声温度83 ℃、超声功率300 W、超声时间79 min,溶剂提取法工艺参数调整为:液料比1∶30 g/mL、乙醇体积分数82%、提取温度84 ℃、提取时间120 min。

1.2.6 龙牙楤木皂苷抗氧化活性的测定

1.2.6.1 DPPH·清除能力的测定 参考文献[13]的方法,在2.00 mL龙牙楤木皂苷样液中加入2.00 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液,混匀室温下避光静置20 min后,在517 nm处测定吸光值,DPPH·清除率按下列公式计算。

式中:A0为样品空白组吸光值;A1为样品组吸光值;A2为对照组吸光值。

式中:A0为样品空白组吸光值;A1为样品组吸光值;A2为对照组吸光值。

1.2.6.3 总还原能力的测定 参考文献[15]的方法,并作出改动。龙牙楤木皂苷样液1.00 mL加入2.50 mL 1%铁氰化钾溶液,在50 ℃下反应20 min,速冷后向溶液加入2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液,5 min 后,加入5.00 mL去离子水,0.50 mL 0.1%三氯化铁溶液,反应30 min,在700 nm处测定吸光值。

1.2.7 龙牙楤木皂苷抑菌活性的测定 采用滤纸片扩散法[16],在无菌条件下取100 μL 含菌数为106CFU/mL菌悬液均匀涂布于培养基上,用无菌镊子夹取直径为6 mm的滤纸片,平铺在含菌培养基上,取15 μL不同浓度的龙牙楤木皂苷提取物滴在滤纸片上,采用无菌蒸馏水作为阴性对照,青霉素-链霉素混合液作为阳性对照,37 ℃培养24 h 后,用游标卡尺测量抑菌圈直径。

采用二倍稀释法对龙牙楤木皂苷提取物的抑菌活性进行定量分析[17]。在灭菌试管内,依次加入不同浓度的龙牙楤木皂苷溶液和液体培养基,使总体积为4 mL。每个试管中再加入50 μL含菌量为106CFU/mL菌悬液,37 ℃恒温振荡培养24 h。试管中分别取50 μL含龙牙楤木皂苷提取液的菌悬液涂布于平板上,每个浓度梯度重复涂布3次,培养24 h完全不长菌落时的浓度为最小抑菌浓度MIC值,培养48 h完全不长细菌时的浓度为最小杀菌浓度MBC值。

1.3 数据处理

试验均平行检测3次,利用Design-Expert 8.0.5、SPSS 21.0进行数据处理及统计分析,并用Origin 8.0作图,数据结果以平均值±标准方差(means±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对龙牙楤木皂苷得率的影响 由图2可知,料液比在1∶10～1∶25 g/mL的范围内,随着乙醇提取溶液用量的不断增大,龙牙楤木皂苷的得率也在不断增加,龙牙楤木皂苷最高得率为3.99%,但是当料液比超过1∶25 g/mL时龙牙楤木皂苷得率呈下降趋势。这是因为料液比过低不利于真空超声体系活跃形成微沸腾状态,随着提取液的增加,加大了质量浓度差及固液接触面积,有利于提高真空超声体系下微沸腾状态分子扩散速度,同时随着料液比的增大,溶剂传质推动力增大,使龙牙楤木物料与提取溶液充分接触,扩散到溶液中的皂苷也就越多[18]。但是料液比过大,分子扩散速度几乎不会发生明显变化。但汉龙等[19]提取无患子皂苷发现料液比超过1∶30 g/mL不利于协同浸提,得率反而下降,同时料液比过大也会造成溶剂和能源的浪费,给后续的分离工作增加难度,因此选择1∶25 g/mL为最佳的皂苷提取料液比。

图2料液比对皂苷得率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratioon the yield of saponins

2.1.2 乙醇体积分数对龙牙楤木皂苷得率的影响 由图3可知,当乙醇体积分数由20%上升至80%时,龙牙楤木皂苷得率随之上升,乙醇体积分数80%时,皂苷得率最高为3.61%,比乙醇体积分数20%的得率高出97.27%,继续升高乙醇的体积分数,皂苷得率下降。由结果可知,乙醇体积分数过高或过低都不利于龙牙楤木皂苷类化合物的溶出。这可能是因为皂苷虽可溶于水,但水不能破坏氢键,加入乙醇可破坏氢键,从而提高皂苷的得率,但当乙醇浓度过高时,由于真空超声体系下乙醇更易挥发,上升的蒸汽无法及时回流入体系内,使得皂苷提取得率下降。赵亚东等[20]采用超声辅助乙醇溶液提取青海藜麦皂苷,单因素实验结果表明乙醇体积分数90%时,得率最高。进一步提高乙醇浓度皂苷提取为下降的趋势,其认为是乙醇浓度过高,导致细胞紧缩,影响皂苷进入溶剂。皂苷是一类极性化合物,乙醇溶液是极性溶液,乙醇溶液浓度的变化势必导致溶液极性的改变,物质在其极性接近的溶液中溶解度最好,因此选择80%乙醇溶液为最佳的皂苷提取乙醇体积分数。

图3 乙醇体积分数对皂苷得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentrationon the yield of saponins

2.1.3 真空度对龙牙楤木皂苷得率的影响 由图4可知,在0.04 MPa接近常压条件下,龙牙楤木皂苷的提取得率为2.52%,而在0.08 MPa接近真空时,龙牙楤木皂苷的提取得率为3.98%,是0.04 MPa条件下的1.58倍。试验结果表明相同试验条件下,减压处理比常压条件更有利于龙牙楤木皂苷的溶出,这是因为真空度上升,提取液沸点降低,体系活跃能很快缩小溶液的浓度差,加快有效成分向溶液里扩散速度。同时,超声波的空化效应是从液体内部溶液形成,即从内部产生微小汽泡并迅速长大和膨胀的作用,因此可活跃提取体系,加速植物细胞膜的破裂,从而起到了提高活性成分的释放,因而皂苷得率上升,但由于真空度继续上升,提取体系剧烈沸腾,导致乙醇蒸汽无法迅速冷凝回流入提取体系,造成皂苷提取得率的下降[9]因此选择0.08 MPa为皂苷最佳提取真空度。

图4 真空度对皂苷得率的影响Fig.4 Effect of vacuum degreeon the yield of saponins

2.1.4 超声温度对龙牙楤木皂苷得率的影响 由图5可知,在20～60 ℃范围内,随着超声温度的升高,龙牙楤木皂苷的得率呈上升趋势,皂苷得率峰值为3.84%,这是因为随着超声温度升高,真空超声体系空化泡数量增多,逐渐形成微沸腾转态,同时提取溶液的黏度降低,扩散系数增加,从而增大龙牙楤木皂苷的溶出。继续升高温度,皂苷的得率不再上升且剧烈下降。皂苷类化合物本不是热敏性物质,其超过一定超声温度得率剧烈下降可能是因为在真空条件下,提取溶液的沸点降低,超声温度过高体系剧烈沸腾,导致提取溶剂挥发过快,无法及时冷凝回流,造成一定的损失,此外随着温度的继续升高,叶绿素、纤维素等杂质溶出增多[21],因此为保证提取得率,最佳超声温度为60 ℃。

图5 超声温度对皂苷得率的影响Fig.5 Effect of extraction temperatureon the yield of saponins

2.1.5 超声功率对龙牙楤木皂苷得率的影响 由图6可知,随着超声功率的增加,龙牙楤木皂苷得率呈先上升后平缓的趋势,在270 W时提取得率达到峰值,最大提取得率为3.98%,是提取功率为150 W时的1.39倍,这是因为超声波的热效应、空化效应和机械剪切效应能够迅速破坏细胞结构,促进了分子间相互运动作用的程度,加速皂苷类化合物扩散溶解,同时负压条件使超声波空化效应产生的空化泡数量增加,有利于提取体系的活跃从而提高了皂苷的得率,考虑到270 W后皂苷得率基本不再变化,且进一步提高超声功率能耗增大,因此选择超声波功率270 W为最佳提取条件。

图6 超声功率对皂苷得率的影响Fig.6 Effect of ultrasound poweron the yield of saponins

表2 Plackett-Burman试验设计及结果Table 2 Results of Plackett-Burman experimental design

表3 Plackett-Burman试验方差分析结果Table 3 Results of Plackett-Burman variance analysis

2.1.6 超声时间对龙牙楤木皂苷得率的影响 由图7可知,在超声时间30～50 min的范围内,随着时间的延长,真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷的得率逐渐增加,最大提取得率为3.89%,当超声时间超过50 min,随着时间的延长,皂苷得率呈现略微下降趋势,其原因可能是超声波效应使细胞破碎的越来越完全,同时低压条件下体系活跃,因而皂苷得率上升,继续超声由于提取体系的负压条件,分子运动剧烈,皂苷溶出的同时细胞内大量不溶物及较多黏液质等混入提取液中,使溶液黏度增大,传质阻力增大,影响皂苷的进一步溶出[22],因此选取超声时间50 min为最佳超声时间。

2.2 Plackett-Burman试验结果

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Results of Box-Behnken experimental design

表5 回归方程系数显著性检验Table 5 Significance test of regression equation coefficients

采用Plackett-Burman试验对影响因素进行显著性分析,试验设计和方差分析结果见表2和表3,其中显著影响因素依次为:料液比、超声温度、真空度、超声功率,影响不显著因素为乙醇体积分数和超声时间,因此采用Box-Behnken中心组合试验,以料液比(A)、超声功率(B)、超声温度(C)、真空度(D)为自变量,龙牙楤木皂苷得率为因变量,建立4因素3水平响应面优化提取工艺。

2.3 响应面试验结果

利用统计学分析软件Design Expert 8.0.5软件建立数学回归模型,确定龙牙楤木皂苷最佳提取工艺条件,响应面试验设计及结果见表4和表5。

采用Design-Except 8.05软件对表4试验数据进行多元回归拟合,获得的响应值皂苷得率(Y)对液料比(A)、超声功率(B)、超声温度(C)、真空度(D)真实值的回归模型方程为:Y=4.17+0.058A+0.12B-0.20C-0.16D+0.20AB+0.20AC+0.18AD-0.31BC-0.052BD-0.0025CD-0.27A2-0.77B2-0.53C2-0.48D2。

图8 各因素交互作用影响皂苷提取得率的响应面图Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the yield of saponins

由表5可知模型的P值小于0.0001,表明该模型二次方程极显著,失拟项不显著(P=0.3981)。回归方程的决定系数R2为0.9683,说明该回归方程能很好地描述各因素与响应值之间的真实关系,可以用其确定最佳提取工艺条件。调整决定系数为0.9366,说明该模型能够解释93.66%的响应值变化,因而模型的拟合度良好,可对不同提取条件下龙牙楤木皂苷提取得率进行预测。由方差分析结果可知,超声温度对龙牙楤木皂苷的得率影响最大,其次依次是真空度、超声功率、料液比。模型中一次项A和交互项BD、CD差异不显著,一次项B、C、D,交互项AB、AC、BC以及二次项A2、B2、C2、D2对龙牙楤木皂苷得率均有极显著的影响。

根据龙牙楤木皂苷回归模型做出相应的三维球面图,如图8所示。响应面曲面的坡度可反映该因素对龙牙楤木皂苷得率影响的强弱程度。等高线的形状表明因素之间的交互影响是否显著。圆形等高线表明两因素之间的交互影响不显著;椭圆形等高线表明两因素之间的交互影响显著[23]。如图8a～图8d所示,响应面显示坡度较陡,等高线呈马鞍形或椭圆形,表明液料比和超声功率、液料比和真空度及超声温度和超声功率之间交互作用显著,对龙牙楤木皂苷的提取得率影响较大,这与方差分析结果一致。超声功率和真空度、超声温度和真空度交互作用对响应值的影响都不显著,表现为曲线平滑,等高线为圆形,与方差分析结果相符。

2.4 回归模型的验证

对真空耦合超声波法、常压超声法、溶剂提取法的最佳工艺调整后进行验证试验,模型验证结果如图9所示。

图9 三种提取方法的响应面验证分析Fig.9 Response surface verification of three extraction methods注:字母不同表示具有显著性差异,P<0.05。

由图9可知,真空耦合超声波法最优条件下提取龙牙楤木皂苷得率为4.18%±0.092%,常压超声法最优条件下提取龙牙楤木皂苷得率为3.80%±0.155%,溶剂提取法最优条件下提取龙牙楤木皂苷得率为3.62%±0.131%。真空耦合超声波法提取龙牙楤木皂苷得率依次是常压超声、溶剂提取的1.10倍、1.15倍,且差异性显著,而最高得率的提取时间真空耦合超声波依次是常压超声、溶剂提取的0.63倍、0.42倍,表明真空耦合超声波法能缩短提取时间,且能提高提取得率。

2.5 龙牙楤木皂苷抗氧化性分析

DPPH自由基性质稳定,通常当做自由基清除能力的标准物质。超氧阴离子自由基本身有毒性,且可生成羟基自由基,使机体处于过氧损伤状态[24]。活性物质的抗氧化能力与还原力具有一定的相关性,因此本试验选定清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基能力和总还原能力评价龙牙楤木皂苷的抗氧化能力,结果如图10所示。

图10 龙牙楤木皂苷抗氧化能力Fig.10 The antioxidant capacity ofsaponins from aralia elata

由图10可知,随着皂苷质量浓度的升高,三种提取方法提取的龙牙楤木皂苷的抗氧化能力均加强,呈现明显的剂量依赖关系。在质量浓度为1.5 mg/mL时,真空耦合超声波、常压超声、溶剂提取制备的龙牙楤木皂苷对DPPH自由基的清除率依次为92.33%、81.03%、78.56%,是初始浓度的3.48倍、2.94倍、3.51倍。最高浓度时,真空耦合超声波提取的皂苷DPPH自由基清除能力与同浓度的VC接近。龙牙楤木皂苷能清除DPPH自由基可能是因为皂苷释放氢离子,配对孤对电子,使DPPH自由基生成稳定的化合物[25]。

在试验浓度范围内,随着皂苷质量浓度的升高,龙牙楤木皂苷对超氧阴离子自由基的清除率增大。质量浓度为6 mg/mL时,真空耦合超声波、常压超声、溶剂提取制备的龙牙楤木皂苷对超氧阴离子自由基的清除率达到最大值,依次为95.64%、88.28%、80.35%,提高了3.19倍、3.42倍、5.20倍,抗氧化能力均低于VC。邻苯三酚碱性条件下自氧化生成有色中间产物,并释放超氧阴离子自由基。龙牙楤木皂苷清除超氧阴离子自由基可能是因为其活性氢与超氧阴离子自由基结合生成水,中断中间有色产物的积累。

表6 龙牙楤木皂苷抑菌直径Table 6 Inhibition zone diameters of aralia elata saponin against different microorganisms

注:-代表无抑菌圈

表7 龙牙楤木皂苷最低抑菌浓度Table 7 Minimum inhibitory concentrations of aralia elata saponin against different microorganisms

表8 龙牙楤木皂苷最低杀菌浓度Table 8 Minimum bactericidal concentration of aralia elata saponin against different microorganisms

注:-:没有菌生长;+:有少量菌生长;++:有一定量菌生长;+++:有大量菌生长。

三种提取方法提取龙牙楤木皂苷总还原能力的强弱依次为真空耦合超声波法、常压超声法、溶剂提取法,但三种提取方法提取的龙牙楤总还原能力均低于VC。在试验浓度范围内,真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷总还原能力由0.105上升至0.893、常压超声由0.097上升至0.614、溶剂提取由0.10上升至0.594。龙牙楤木皂苷打破自由基链,导致Fe3+得到电子还原成为Fe2+。真空耦合超声波、常压超声、溶剂提取龙牙楤木皂苷清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的IC50依次为0.344、0.528、0.560、1.367、1.857、2.389 mg/mL,总还原能力强弱依次为真空耦合超声波、常压超声、溶剂提取,方差分析两两比较差异显著,表明真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷不会破坏皂苷类化合物的抗氧化活性且抗氧化活性更强,可能因为真空耦合超声波法相比于常压超声和溶剂提取法降低了热敏性活性物质随温度升高造成的氧化和降解,且体系沸点降低,分子运动活跃,促使更多活性成分溶出。

2.6 龙牙楤木皂苷抑菌活性分析

本试验为研究龙牙楤木皂苷抑菌活性,选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌Staphylococcus、枯草芽孢杆菌3种供试菌种,采用滤纸片扩散法,通过测定抑菌圈直径的大小来判断抑菌活性的强弱,结果如表6,最低抑菌浓度和最小杀菌浓度结果如表7、表8所示。

由表6可知,从三种方法制备的龙牙楤木皂苷抑菌效果来看,真空耦合超声波法提取的皂苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果最好,当皂苷浓度为 10 mg/mL时,对大肠杆菌的抑菌圈直径为10.36±0.35 mm,达到阳性对照组的29.43%,对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为9.57±0.42 mm,达到阳性对照组的23.65%。与阳性对照和阴性对照抑菌试验相比,真空耦合超声波、常压超声和溶剂提取三种方法提取的龙牙楤木皂苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌效果,而对枯草芽孢杆菌没有抑制作用。三种方法制备的龙牙楤木皂苷随着浓度的增加,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果增强,这种量效关系可能是因为随着提取物浓度的增大导致细菌细胞膜外渗透压增大,细胞质外渗,同时导致细胞膜塌陷降解,失去正常的对周围物质的选择性吸收、转运和代谢途径,这种破坏性对整个菌体表面形态具有普遍性,其范围大小与剂量相关[26]。从结果可以看出,真空耦合超声波法由于在真空条件下溶剂沸点降低,溶剂分子之间分子量能量降低,对皂苷结构破坏减弱,同时真空条件可能减弱超声波场强对皂苷结构的破坏,因此有利于皂苷抑菌功能不被破坏。

由表7和表8可知,真空耦合超声波、常压超声、溶剂提取制备的龙牙楤木皂苷在试验浓度范围对3种菌株的MIC和MBC值之间差异较大,对大肠杆菌的MIC和MBC依次为2.5和5 mg/mL、5和10 mg/mL、10和10 mg/mL,其中真空耦合超声波制备的皂苷对大肠杆菌MIC、MBC值最小,表明其抑菌效果最佳。三种提取方式制备的皂苷对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC均为20和40 mg/mL,试验结果与表3抑菌效果一致。三种提取方法制备的龙牙楤木皂苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果,抑菌效果强弱为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌,这可能是因为革兰氏阴性菌,其细胞壁薄,肽聚糖含量低层次少,转运通道多,龙牙楤木皂苷极易进入从而产生抑制作用,革兰氏阳性菌,细胞壁较厚,肽聚糖含量高且相互交联形成坚固稳定的的立体网状结构,以及芽孢强抗逆性使得龙牙楤木皂苷对枯草芽孢杆菌的作用较弱[27]。

3 结论

通过单因素实验和响应面试验确定了真空耦合超声波提取龙牙楤木皂苷的最佳工艺条件为乙醇溶液体积分数80%、超声温度57.7 ℃、液料比1∶25.1 g/mL、超声时间50 min、超声功率273.9 W、真空度0.0784 MPa,此条件下龙牙楤木皂苷的提取得率理论值为4.21%,实际值为4.18%,与预测值相差0.47%。功能试验表明,采用真空耦合超声波法制备的龙牙楤木皂苷的体外抗氧化功能和抑菌功能都强于常压超声法和溶剂提取法制备的龙牙楤木皂苷。可以得出,真空耦合超声波法能够显著提高龙牙楤木皂苷得率(P<0.05),并很好地保留了皂苷的抗氧化活性和抑菌活性。因此本试验对龙牙楤木皂苷高效制备及在食品、药品等领域开发天然抗氧化剂提供一定的理论依据。