益气化瘀中药对糖尿病溃疡大鼠瘢痕形成的影响及其机制

张臻，阙华发

(上海中医药大学附属龙华医院中医外科研究所，上海200032)

糖尿病溃疡是糖尿病常见但较严重的慢性并发症之一，是糖尿病患者残疾和死亡的主要原因之一。如何促进糖尿病溃疡创面愈合，降低截肢率和致残率，尽可能减少瘢痕形成，提高愈合质量，是学科研究热点。目前西医治疗集中在控制血糖、控制感染、改善肢体血液循环、局部清创术及植皮术、外用生长因子、介入等措施，总体疗效不理想，截肢率及致残率仍较高。中医采用全身治疗与局部外治相结合，能加速创面愈合，降低致残率，一定程度上减少瘢痕的形成，但其治疗机制尚未明确。因此，从中医药方面探讨促进糖尿病溃疡愈合的作用机制和作用靶点，对进一步提高临床疗效、降低截肢率和致残率、改善愈合质量有重要的理论意义。我们以益气化瘀中药治疗糖尿病溃疡，取得了显著的临床疗效[1]。实验研究已初步证实，创面TGF-β1低表达可能导致糖尿病溃疡难以愈合，Smad3、Smad4表达下调可促进创面愈合[2～5]。2016年，本研究进一步观察了益气化瘀中药对糖尿病溃疡大鼠瘢痕形成的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物与试剂 实验动物：3月龄雄性SPF级Wistar大鼠50只，体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[许可证号SCXK(沪)2012-0002]。药物：益气化瘀方由生黄芪、太子参、桃仁、地龙等组成，人鼠等效剂量为11.61 g/kg，减压浓缩至生药浓度2.5 g/mL；拆方益气方由生黄芪、太子参等组成，人鼠等效剂量为6.75 g/kg，减压浓缩至生药浓度1.5 g/mL；拆方化瘀方由桃仁、地龙等组成，人鼠等效剂量为4.86 g/kg，减压浓缩至生药浓度1 g/mL。均由上海中医药大学附属龙华医院制剂室按水煎醇沉工艺制备成煎剂浓缩，4 ℃冰箱保存备用。试剂：激活素受体样激酶5(ALK5)一抗，Abcam公司产品(Ab155258)；Smad2一抗，Abcam公司产品(Ab33875)；Smad3一抗，Abcam公司产品(Ab40854)；HRP标记山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司产品(ZB-2301)。

1.2 糖尿病溃疡模型制作 大鼠实验前12 h禁食，定量饮水。实验当日称体质量，以pH 4.6、0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素(STZ)，配成1%溶液，以60 mg/kg单次腹腔内注射STZ溶液，48 h后测血糖浓度>16.65 mmol/L、尿糖为++++时，即糖尿病模型制作成功[6]。将糖尿病大鼠麻醉后于背部备皮并常规消毒，标记后以手术剪剪除直径10 mm的皮肤，形成皮肤溃疡创面，术后以无菌纱布包扎，完成糖尿病溃疡模型制作。造模后连续4 d于大鼠后腿肌内注射青霉素40万U预防感染。

1.3 动物分组及给药方法 将大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病模型组和正常对照组，每组10只。益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病模型组制作糖尿病溃疡模型。正常对照组、糖尿病模型组以生理盐水灌胃，1次/d；益气化瘀组、益气组、化瘀组分别给予益气化瘀方2.5 g/mL、益气方1.5 g/mL、化瘀方1.0 g/mL灌胃，1次/d。

1.4 瘢痕厚度及瘢痕指数计算 在创面愈合1个月(瘢痕增生期)时，将大鼠麻醉处死，用眼科手术剪剪取全层皮肤瘢痕组织，以游标卡尺测量周围正常皮肤厚度及瘢痕厚度，精度为0.02 mm。瘢痕指数=(瘢痕厚度-周围正常皮肤厚度)/周围正常皮肤厚度[7]。

1.5 瘢痕组织Ⅰ型胶原检测 取瘢痕组织进行HE染色，切片;采用显微图像分析系统，在每张切片随机采集3幅染色图，分析Ⅰ型胶原相对含量。

1.6 瘢痕组织中ALK5、Smad2、Smad3检测 以植块培养法进行成纤维细胞培养，并以Western blotting法检测ALK5、Smad2、Smad3。每组随机抽取8个标本作为实验样本，各样品取25 μg上样，将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，进行电泳。然后转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，分别与特异性抗体进行孵育(稀释浓度分别为ALK5 1∶500，Smad2 1∶1 000，Smad3 1∶5 000，GAPDH 1∶1 500)。充分洗涤后加HRP标记山羊抗兔二抗孵育，ECL染色。Tanon5200化学发光成像系统显影及扫描，Image J软件分析灰度值表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组瘢痕厚度、瘢痕指数比较 益气化瘀组、益气组、化瘀组及正常对照组的瘢痕厚度、瘢痕指数均低于糖尿病模型组(P均<0.01)，益气化瘀组瘢痕厚度、瘢痕指数与正常对照组差异无统计学意义。见表1。

表1 各组瘢痕厚度、瘢痕指数比较

注：与正常对照组相比，△P<0.01；与糖尿病模型组相比，*P<0.01。

2.2 各组瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量比较 益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病模型组、正常对照组瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量分别为(618.63±11.11)、(822.50±9.75)、(763.88±12.40)、(838.00±15.6)、(521.00±5.16)μm2。正常对照组瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量低于其余各组(P均<0.01)。益气化瘀组、益气组、化瘀组瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量低于糖尿病模型组(P均<0.05)。

2.3 各组瘢痕组织中ALK5、Smad2、Smad3表达比较 益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病模型组瘢痕组织中ALK5相对表达量高于正常对照组，糖尿病模型组Smad2相对表达量高于正常对照组，益气组、化瘀组、糖尿病模型组Smad3相对表达量高于正常对照组(P均<0.01)。益气化瘀组、益气组、化瘀组ALK5、Smad3相对表达量低于糖尿病模型组(P均<0.05),益气化瘀组Smad2相对表达量低于糖尿病模型组(P<0.05)。见表2。

表2 各组瘢痕组织中ALK5、Smad2、Smad3表达比较

注：与正常对照组相比，△P<0.01；与糖尿病模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

近年来针对糖尿病溃疡创面愈合机制的研究不断深入，多种因素已被证实与糖尿病创面愈合的速度及瘢痕形成程度有关。临床最常见的瘢痕为增生性瘢痕，其病理基础是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖和以胶原为主的细胞外基质过度沉积。而在创面愈合过程中，多种生长因子参与调控。其中，TGF-β是一种重要的血管形成因子，主要作用是调节细胞生长和分化，其在溃疡创面组织中的含量与溃疡发生和修复状态有着密切的关系。同时，TGF-β也是最强的致纤维化因子之一，在多种脏器纤维化进程和皮肤瘢痕形成中有重要作用[8,9]。TGF-β能增加Ⅰ、Ⅲ型胶原(特别是Ⅰ型胶原)沉积，而Ⅰ型胶原是皮肤瘢痕的重要组成成分。此外，TGF-β还能抑制胶原酶活性、促进纤维粘连蛋白表达，促进细胞外基质沉积。多种因素共同作用，最终导致组织纤维化，瘢痕形成[10～13]。

将TGF-β信号直接从细胞膜转入细胞核内的代表性信号转导分子为Smads蛋白[14]。Smads蛋白家族目前被认为是一种修复相关基因，与创面愈合有密切关系。而TGF-β的Ⅰ型受体是ALK，其与其配体结合进一步转导信号。最新研究发现，TGF-β超家族信号转导有2条通路：一是TGF-β/ALK1/Smad1/5途径，与新生血管形成密切相关；一是TGF-β/ALK5/Smad2/Smad3途径。动物脏器纤维化模型研究结果显示，通过药物抑制ALK5活性，可降低脏器中致纤维化基因表达水平，减少胶原沉积，从而减轻纤维化程度，还能同时拮抗ALK1信号通路[15,16]。TGF-β超家族的这两条信号通路可能相互影响，并可能与创面愈合的速度和瘢痕化程度密切相关。

中医认为糖尿病溃疡属“溃疡”“消渴”等范畴。糖尿病溃疡病机演变的特点总结概括为“因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，化腐致损”。并且，“虚”和“瘀”是糖尿病溃疡创面长期不愈的主要因素。根据《医林改错》中“元气既虚，必不能达于血管，血管无力，必停留而瘀”等中医理论，我们确立了“益气化瘀法”的治疗法则和相应的理法方药，形成了完整的学术思想体系和系统治疗方法，临床疗效明显提高，不仅可促进创面愈合，在一定程度上还能缓解瘢痕形成，提高愈合质量[17,18]。

本研究观察了益气化瘀中药对糖尿病溃疡大鼠瘢痕形成的影响，结果显示，益气化瘀组、益气组、化瘀组及正常对照组的瘢痕厚度、瘢痕指数均低于糖尿病模型组，证实益气化瘀方可缓解糖尿病溃疡瘢痕形成。本研究中，益气化瘀组、益气组、化瘀组瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量低于糖尿病模型组，ALK5、Smad3相对表达量低于糖尿病模型组，且益气化瘀组Smad2相对表达量低于糖尿病模型组，提示糖尿病溃疡难以愈合及瘢痕形成的原因可能与ALK5、Smad2、Smad3有关，而益气化瘀方药及其拆方可能通过抑制ALK5/Smad2/Smad3通路而达到延缓瘢痕形成的作用。由此推测，益气化瘀中药不仅可能通过上调ALK1/Smad1/Smad5促进创面愈合[19]，还可能通过抑制ALK5/Smad2/Smad3通路[20]，减少瘢痕形成。本研究初步证实了益气化瘀中药促进创面愈合、提高愈合质量可能的途径，但具体的机制仍有待进一步研究论证。