2型糖尿病并发冠心病患者血浆miRNA-let7家族表达变化及诊断价值分析

杜开慧，陈龙，张斌强，徐先琳，陈琴华，陈继舜

(1锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地，湖北十堰442008；2湖北医药学院附属国药东风总医院；3武当中药特色研究湖北省重点实验室)

2型糖尿病(T2DM)患者常合并心、脑、肾、眼等多器官损害，其中心血管损害是T2DM患者死亡的主要原因。研究表明，T2DM患者心血管疾病死亡风险是非糖尿病患者的2～3倍[1]。目前普遍认为，血糖控制达标的患者，冠心病(CHD)发病率相对减少；但我们在临床工作中发现，部分血糖控制不佳的患者冠状动脉血管情况较好，而部分血糖控制较好的患者冠状动脉血管情况较差。鉴于此，我们推测，T2DM并发CHD可能与某些基因表达变化有关。微小RNA(miRNA)作为小的非编码RNA分子，通过调节转录后水平的基因表达，在许多疾病发病和进展中起着重要作用。研究发现，miR-100、miR-let7、miR-21、miR-92a、miR-223在有T2DM并发症患者及CHD患者的血浆中均有异常表达[2～7]，其中，miR-let7家族在动脉粥样硬化和糖尿病相关内皮细胞功能障碍、血管平滑肌细胞增殖和炎症反应的过程中有着至关重要的作用[2]。因此，miR-let7家族表达与T2DM并发CHD可能有一定联系。本研究观察了T2DM并发CHD患者血浆miR-let7家族的表达变化，分析miR-let7对T2DM并发CHD的诊断价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年4～12月在我院心内科和内分泌科住院患者224例(男124例、女100例)，其中，单纯T2DM患者76例为T2DM组，男40例、女36例，糖尿病病程(5.8±1.3)年；T2DM合并CHD患者60例为T2DM+CHD组，男36例、女24例，糖尿病病程(6.1±1.7)年。另选择88例年龄、性别相匹配的健康体检者为对照组，男48例、女40例。排除1型糖尿病、恶性肿瘤、重要脏器严重功能障碍、急性心包炎及心肌炎、先天性心脏病、心律失常、免疫系统疾病、肺动脉栓塞、结缔组织病、脑血管病及急慢性感染患者。本研究通过医院伦理委员会批准，研究对象均知情同意。三组性别、年龄资料具有可比性，T2DM组与T2DM+CHD组糖尿病病程差异无统计学意义。

1.2 血浆miR-let7检测 所有研究对象晨起使用EDTA抗凝管采空腹静脉血5 mL，充分混匀后置于4 ℃冰箱，4 h内分离血浆，2 000 r/min离心5min，分离血浆，用TRIzol Reagent LS提取总RNA，置于-80 ℃冷冻保存。使用miSceipt Ⅱ RT Kit(50)试剂盒进行逆转录，总反应体系共20 μL：5×miScript HiSpec Buffer 4 μL，10×Nucleics Mix 2 μL，RNase-free Water 4 μL， miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μL，Template RNA 8 μL。全过程需在冰上操作，逆转录产物加180 μL的DEPC水稀释，-20 ℃保存。待测miR-let7家族引物序列见表1。内参为miR-423。使用美国miSriptR SYBRR Green PCR Kit(200)试剂盒。PCR反应体系包括2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、10×miScript Universal 2.5 μL、10×miScript Primer Assay 2.5 μL、RNase-free Water 1.5 μL、Template cDNA 1 μL。反应条件为95 ℃ 10 min起始模板预变性，94 ℃ 15 s模板变性，55 ℃ 30 s退火，70 ℃ 30 s延伸，循环40次。采用博日实时荧光定量PCR仪测定Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-let7相对表达量。

表1 待测miR-let7家族引物序列

2 结果

2.1 各组血浆miR-let7家族表达比较 各组血浆miR-let7a-1、miR-let7a-2、miR-let7a-3、miR-let7c、miR-let7d、miR-let7e表达水平差异无统计学意义(P均>0.05)。T2DM+CHD组患者血浆miR-let7b、miR-let7i相对表达量高于T2DM组，miR-let7g、miR-let7f-1相对表达量低于T2DM组(P均<0.01)。见表2。

表2 各组血浆miR-let7家族表达比较

2.2 血浆miR-let7对T2DM及T2DM并发CHD的诊断效能 miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i诊断T2DM的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.937 8(95%CI0.846 6～1.029 0，P<0.01)、0.997 6(95%CI0.989 8～1.005 0，P<0.01)、0.839 7(95%CI0.706 3～0.973 1，P<0.01)、0.925 4(95%CI0.850 4～1.020 0，P<0.01)；miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i诊断T2DM+CHD的AUC分别为0.809 1(95%CI0.846 6～1.029 0，P<0.01)、0.872 7(95%CI0.732 2～1.013 0，P<0.01)、0.751 5(95%CI0.558 8～0.944 2，P<0.01)、0.812 1(95%CI0.645 2～0.979 1，P<0.01)。见图1。

注：a为miR-let7b的ROC曲线;b为miR-let7f-1的ROC曲线;c为miR-let7g的ROC曲线;d为miR-let7i的ROC曲线。

图1 血浆miR-let7诊断T2DM及T2DM并发CHD的ROC曲线

3 讨论

T2DM合并CHD患者常表现为多支、弥漫病变，病情更重，预后更差，对患者生命造成严重威胁[8]。CHD是T2DM最常见的大血管并发症。冠状动脉造影检查是诊断CHD的惟一金标准，但检查费用高、创伤大、临床并发症较多，一般不作为体检常规项目。因此需要积极寻找新的生物标志物，为T2DM合并CHD寻找早期的预测指标，对危险因素尽早进行干预。miRNA是一类长度为21～25个核苷酸的内源性非编码RNA，主要通过碱基配对与靶基因的3′UTR结合，促进靶基因的降解或抑制转录后翻译。近年来，miR-let7在心血管疾病和糖尿病中的作用受到了广泛关注，其在血管平滑肌细胞[9]、内皮细胞[10]、心肌细胞[11,12]和冠状动脉平滑肌细胞[13]中均高表达。有研究表明，miRNA在糖尿病的代谢和抗血管形成的表观遗传调控中具有重要作用，且可能与糖尿病并发症有关[14]。因此，我们推测miR-let7在T2DM并发CHD的病理过程中起重要作用。

在缺氧诱导下，HIF1α-let7b-Ago1-VEGF信号通路可促进新生血管的形成，从而促进动脉粥样硬化的形成[15]。Roitbak等[15]发现，当小鼠体内miR-let7i表达降低时，IGF-1R受到抑制，进一步激活胰岛素信号通路，导致胰岛素分泌受损，糖耐量异常，同时作用于Toll样受体4信号通路，降低LDL的合成，抑制动脉粥样硬化形成[16]。本研究结果显示，T2DM+CHD组患者血浆miR-let7b、miR-let7i相对表达量高于T2DM组，提示miR-let7b、miR-let7i可能参与了T2DM患者动脉粥样硬化的形成，进一步导致CHD。

有学者上调了野生型小鼠中miR-let7f-1的表达，发现小鼠出现胰岛素敏感性降低伴胰岛素分泌不足，血糖逐渐升高，最终发展为糖尿病[17]。还有研究表明，miR-let7f-1通过与胰岛素样信号通路中的3′UTR位点相结合抑制IGF-1的表达，从而促进动脉粥样硬化的发生[18]。Zhu等[19]进行小鼠体外研究发现，调节miR-let7g/LIN28通路，增强胰岛素-PI3K-mTOR途径活性和胰岛素敏感性，可进一步影响血糖水平。另外一项研究表明，ox-LDL进入血管平滑肌细胞时miR-let-7g表达量减少，可能与ox-LDL诱导细胞增殖、迁移、自噬和凋亡有关;miR-let7g也可直接作用于LOX-1的下游因子Ca2+、PKC和OCT-1，从而调节血脂代谢[20]，最终促进动脉粥样硬化的形成。本研究结果显示，T2DM+CHD组血浆miR-let7g、miR-let7f-1相对表达量低于T2DM组，推测血浆miR-let7g、miR-let7f-1表达降低可能通过上述通路导致T2DM合并CHD的发生。

本研究通过ROC曲线分析了血浆miR-let7b、miR-let7i、miR-let7g、miR-let7f-1对T2DM及T2DM+CHD的诊断价值，结果显示，miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i诊断T2DM的AUC分别为0.937 8、0.997 6、0.839 7、0.925 4；miR-let7b、miR-let7f-1、miR-let7g、miR-let7i诊断T2DM+CHD的AUC分别为0.809 1、0.872 7、0.751 5、0.812 1。血浆miR-let7b、miR-let7i、miR-let7g、miR-let7f-1对T2DM及T2DM+CHD均有一定的诊断效能。结合上述结果，我们认为，miR-let7b、miR-let7i表达降低及miR-let7g、miR-let7f-1表达升高均提示T2DM患者有并发CHD的可能。血浆miR-let7检测为T2DM合并CHD的诊断提供了新思路。