植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹生长、消化性能及物质利用率的影响

2019-11-26韩凤禄戚常乐郭建林卢建挺爽黄志鹏王晓丹陈立侨

水生生物学报 2019年6期

杨璐韩凤禄戚常乐郭建林卢建挺徐畅刘爽黄志鹏王晓丹陈立侨

(1. 华东师范大学生命科学学院, 水生动物营养与水环境健康实验室, 上海 200241; 2. 浙江省淡水水产研究所, 湖州 313001)

豆粕、棉粕、菜粕等植物蛋白源价格低廉, 产量高, 将其添加到水产配合饲料中替代鱼粉已渐成研究热点和饲料开发的趋势[1]。然而, 植物原料中存在的抗营养因子如植酸等, 会对动物体的摄食、生长和养殖环境产生不利影响。植酸, 又被称为肌醇六磷酸, 是植物蛋白原料中一种常见的热稳定性抗营养因子, 它是阳离子和高能磷酸基的储存体,是植物种子和谷物在成熟过程中自然形成的化合物[2]。植酸在豆粕、菜粕中含量达到1%—5%[3,4],当在饲料中添加高比例植物蛋白源时, 其负面影响就会显露出来[5]。对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[6]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[7]、大西洋鲑(Salmo salarL.)[8]等动物的研究证实, 饲料中的植酸会降低消化酶活性, 降低生长性能; 此外, 一些水产动物如鱼类及甲壳类等, 其消化道不能分泌植酸酶[9], 故对于含有植酸的饲料不能进行有效的分解[10], 大部分植酸最终排入水体, 除造成矿物质元素的浪费, 甚至还将污染养殖环境。已有研究表明, 植酸的抗营养作用是植物性原料替代鱼粉有待解决的问题之一[11]。植酸酶, 一种广泛存在于自然界中的细胞外酶[12], 作为一种磷酸酶它能够专一性的对植酸进行逐级分解, 可消除植酸的负面作用[13]。在斑节对虾(Penaeus monodon)[14]的研究中发现, 外源补充植酸酶分解了植酸蛋白化合物,改善虾体的生长性能、提高对蛋白质的消化利用率。同样的, 在真鲷(Pagrus major)[15]饲料中添加2000 U/kg的植酸酶能够显著降低磷排泄, 经济效益和生态效益著。植酸酶对植酸的改善作用是近年来水产动物营养的一个研究热点。

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗称河蟹, 是我国淡水蟹养殖中产量最高的经济物种。随着中华绒螯蟹配合饲料开发和应用比例的提高, 饲料中植物蛋白原料占比也越来越重[16], 有效提高植物原料的替代比例, 提高饲料效率, 能够给中华绒螯蟹养殖带来很多更多的经济效益。植酸酶作为一种饲料添加剂所开展的营养研究已成为热点, 但目前有关植酸酶在中华绒螯蟹饲料中的研究还未见报道。本研究参考Nicolasa等[3], 在饲料中添加10 g/kg植酸钠, 并通过在饲料中添加不同浓度的植酸酶,探讨其对幼蟹作用特点, 观察其在幼蟹的生长、消化性能及营养物质利用方面产生的影响, 从而确定植酸酶的适宜添加量, 结果为今后中华绒螯蟹饲料配方的制定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制作

本实验依据中华绒螯蟹营养需求, 以鱼粉、酪蛋白和明胶为主要蛋白源, 鱼油和豆油为脂肪源,不含植酸和植酸酶的组别作为对照组(C), 处理组在含有10 g/kg植酸的基础上, 添加0、500、1000、1500和2000 U/kg的植酸酶, 分别命名为P0、P500、P1000、P1500和P2000。实验饲料配方组成和化学分析见表 1。在所有饲料原料混匀后, 使用F-26双螺杆挤条机(华东理工大学科技实业总厂, 中国)加工成直径为1 mm的条状饲料, 期间监测螺杆最高温度不高于55℃, 保证温度不会影响植酸酶活力。在室温下风干后, 同样利用挤条机将饲料破碎,使用10目、16目及26目筛子, 将饲料分成不同规格的颗粒, 用自封袋分装好, 每组做好标签并储存于-20℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物与饲养管理

养殖试验在浙江省淡水水产研究所八里店综合试验基地进行。幼蟹购自上海崇明岛, 暂养结束后, 将720只附肢完整、健康的幼蟹(4.34±0.05) g随机分入24个水族桶, 水族桶直径1 m, 水深45 cm。共6组, 每组设置4个重复, 每桶30只幼蟹。每个桶中放入6片瓦片及6个由无毒无味的塑料管捆成的躲避物, 供幼蟹藏匿, 以避免相互残杀。每天在6:30、16:30和21:30饱食投喂, 根据幼蟹的摄食情况及时调整投喂量, 确保残饵较少。投喂2h后吸出残饵并烘干、称重、记录, 并根据蟹体大小适当调整投喂饲料的颗粒规格。在实验过程中每天换水量占总水体1/3, 水温维持在(24±2)℃, 溶解氧＞7.0 mg/L, 总氨氮＜0.2 mg/L。养殖过程中若发现死蟹, 及时捞出并记录日期、重量。养殖试验为期8周。

1.3 样品处理

在8周养殖结束后, 饥饿处理24h后取样。每桶取5只幼蟹用于体组成生化分析, 其余的置于冰上麻醉, 采集肝胰腺、肠道冻存于-80℃冰箱待检。

1.4 消化率实验

消化率试验采用体外消化, 具体参照Huang等[17]和Liu等[18]的方法。将幼蟹置于冰上, 取其胃、肝胰腺和肠道, 清除肠道内容物后称量总消化道重量。加入10倍体积预冷生理盐水(4℃, 0.9%), 用电动匀浆机在冰浴条件下匀浆。4℃, 5000 r/min离心10min, 丢弃上层脂质取上清液作为粗酶液, -80℃冻存, 备用。每个处理设置3个平行。将1 g饲料与2.5 mL粗酶液加入透析袋中扎好, 放入100 mL带塞锥形瓶中, 再加入47.5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液, 置于37℃的恒温水浴振荡器中, 以50 r/min进行离体酶解消化8h。每个样品3个平行, 每个处理重复2次。

1.5 生化分析

取适宜大小的肝胰腺、肠道组织块, 按1:9(m:v)的比例加入预冷的生理盐水, 制成10%匀浆液,2500 r/min 离心10min, 取上清液待测。胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及总蛋白含量试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 按具体说明进行检测。其中,胰蛋白酶: N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)测定法。一个活力单位定义为在pH 8.0, 37℃条件下, 每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003; 淀粉酶: 淀粉-碘显色法。一个活力单位定义为每毫克蛋白在37℃与底物作用30min, 水解10 mg淀粉。脂肪酶: 化学比浊法。酶活力定义: 在37℃条件下, 每毫克蛋白在反应体系中与底物反应1min, 每消耗1 μmol底物为一个酶活力单位。总蛋白含量: 考马斯亮兰法, 单位为mg/mL。

全蟹的常规体组生化成分的分析参考 AOAC(1995)的标准方法。水分测定采用 105℃烘干至恒重法, 粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法(FOSS,Kjeltec2200, Denmark), 粗脂肪测定采用氯仿甲醇法(CM法), 灰分测定采用马弗炉550℃灼烧恒重称量法, 总磷采用钼黄分光光度法, 植酸磷含量测定采用三氯乙酸法(TCA法)。

1.6 生长、消化性能测定

各指标计算公式如下:

其中N0和Nt分别为实验开始和结束时蟹的个数;W0和Wt分别为幼蟹初始和终末重量(g);W为蟹体总增重(g);IF为试验期间总摄食饲料干重(g);IN为试验期间总摄食饲料蛋白质质量(g); d为试验天数;Ni/Nf为蟹体初始/最终某营养成分含量(%);Nd为饲料某营养成分含量(%);m为饲料样品质量(mg);m1为滤渣质量(mg);Lp为滤渣粗蛋白含量(%);m2为透析液中可透析磷/钙质量(mg)。

表1 饲料配方及成分分析(风干基础, %)Tab. 1 Diet formulation and analyzed chemical composition (air dry basis, %)

1.7 数据分析

实验数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示,先用SPSS19.0进行单因素方差(One-way ANOVA)分析, 若存在显著差异(P＜0.05), 则采用Duncan法进行多重比较。

2 结果

2.1 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹生长和饲料利用的影响

如表 2所示, 幼蟹的初始体重无显著性差异(P＞0.05)。随着饲料中植酸酶含量的增加, 幼蟹终末体重、增重率、特定生长率逐渐升高, P2000显著高于P0 (P＜0.05), 对照组与各处理组无显著差异(P＞0.05); 各处理组蛋白质效率都高于P0, P2000及对照组显著高于P0 (P＜0.05); 饲料系数方面则是P0显著高于P2000 (P＜0.05), 其余组之间无显著差异(P＞0.05); 各实验组之间的存活率、摄食量等无显著差异(P＞0.05)。

2.2 植酸酶对中华绒螯蟹体成分的影响

如表 3所示, 随着植酸酶含量增加, 全蟹体磷含量逐渐升高, 其中P1500及P2000显著高于P0(P＜0.05), 其余各处理组之间没有出现显著性的差别(P＞0.05); 各实验组在水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分及钙含量方面无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 植酸酶对中华绒螯蟹消化道消化酶的影响

在肝胰腺中, P0胰蛋白酶活力与P500差异不显著(P＞0.05), 但显著低于其他各组(P＜0.05); 淀粉酶活力则是P2000显著高于其他各组(P＜0.05); 脂肪酶活力各实验之间差异性不显著(P＞0.05)。在肠道中, P2000胰蛋白酶活力与对照组差异不显著, 但显著高于其他各组(P＜0.05); 脂肪酶和淀粉酶活力各实验组之间差异性不显著(P＞0.05, 表 4)。

2.4 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹体外消化率的影响

各实验组在干物质消化率及钙透析率方面差异性不显著(P＞0.05); 蛋白质消化率随植酸酶含量的升高而逐渐升高, P2000显著高于P0 (P＜0.05), 但与对照组没有显著性差异(P＞0.05); 磷透析率有同样的升高趋势, 在P1000、P1500及P2000显著性地高于P0 (P＜0.05), P2000显著性高于对照组(P＜0.05,表 5)。

2.5 氮磷保留率

结果显示, 各实验组幼蟹对氮、磷摄入量差异不显著(P＞0.05); 与P0相比, 添加植酸酶提高了幼蟹氮、磷保留率。P2000氮保留率显著高于各处理组(P＜0.05); P2000磷保留率显著高于P0组(P＜0.05),与其余组没有显著的差异(P＞0.05, 表 6)。

表2 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响Tab. 2 Effects of phytase on the growth performance of the juvenile crab Eriocheir sinensis

3 讨论

已有研究表明, 植物蛋白源能否有效替代优质的鱼粉, 前提是要先消除其抗营养因子的不利影响。然而, 热稳定性抗营养因子采用常规方法往往难以去除, 例如植酸等。已有研究证实, 由于其特有的螯合性质, 配合饲料中的植酸会降低动物体对饲料的消化利用率和物质保留率, 从而抑制机体的生长速度[19]。饲料中植酸含量超过13 g/kg时, 日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼的摄食量和增重率都会显著降低[20]。本实验发现10 g/kg植酸对中华绒螯蟹生长有抑制作用, 并会降低蛋白质效率,导致饲料系数升高, 植酸对幼蟹的负面效应突显。而这种阻抑作用可随着植酸酶添加而得到缓解, 表现为幼蟹的生长性能逐渐得到改善和提高, 当植酸酶含量添加到2000 U/kg时, 中华绒螯蟹的增重率、特定生长率都有显著的提高。与本研究相似, 当凡纳滨对虾摄食2000 FTU/kg植酸酶预处理的大豆粉时, 增重率可达到不添加植酸酶的1.39倍[21], 表明元饲料中添加适量植酸酶有利于提高虾、蟹类甲壳动物的生长性能。究其原因, 植酸酶能够有效地作用于植酸, 使植酸逐步去磷酸化生成一系列低肌醇磷酸酯, 并最终产生自由肌醇与无机磷的过程[22],由此消除植酸对矿质磷及其他营养物质的螯合作用, 这无疑有利于甲壳动物对钙、磷等矿物元素的吸收利用。实验同时发现, 在添加合理剂量的植酸酶后, 中华绒螯蟹的饲料系数显著降低, 同时蛋白质效率显著提高。在大西洋鲑[23]的实验中也发现同样结果, 加入植酸酶后饲料系数从0.84降低至0.75。饲料系数、蛋白质效率是衡量水产动物对饲料利用效率的重要依据[24], 由此可见, 添加植酸酶提高了饲料的利用率, 促进了机体的物质积累, 有效改善了生长性能。

表3 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹全蟹体成分的影响Tab. 3 Effects of phytase on the composition of whole crabs of the juvenile crab Eriocheir sinensis (%)

表4 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹消化酶活力的影响Tab. 4 Effects of phytase on digestive enzymes of the juvenile crab Eriocheir sinensis (U/g prot)

表5 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹体外消化率的影响 (%)Tab. 5 Effects of phytase on the in vitro digestibility of the juvenile crab Eriocheir sinensis (%)

表6 植酸酶对中华绒螯蟹幼蟹氮磷保留的影响Tab. 6 Effects of phytase on nitrogen and phosphorus retention of the juvenile crab Eriocheir sinensis

中华绒螯蟹是一种杂食偏肉食性动物, 在其分泌的消化酶中, 胰蛋白酶完成大部分蛋白质的水解作用, 起到主要的消化功能, 淀粉酶、脂肪酶活性略低[25]。饲料中的植酸会显著降低中华绒螯蟹胰蛋白酶活性, 因为植酸对金属离子有强烈的螯合特性, 植酸会与酶蛋白争夺辅因子而致使消化酶活力下降。同时, 饲料中的蛋白质也会被作为植酸的优选结合底物[26], 被植酸络合后无法完全有效供给动物体吸收利用[19], 这样就会降低中华绒螯蟹对蛋白质的利用。实验发现当植酸酶添加量达到2000 U/kg时, 中华绒螯蟹肝胰腺胰蛋白酶活力明显升高, 且达到与对照组相当的水平, 表明该植酸酶剂量能有效缓解了植酸对消化酶的抑制, 提高机体对蛋白质的消化利用率。此外, 肝胰腺中淀粉酶活力的提高可能与植酸酶释放的金属离子Ca2+有关[19], 相关的具体过程和内在机制尚有待进一步研究。

甲壳动物的生长伴随着蜕壳而实现, 这一过程中将会伴随一些矿物质元素的损失, 所以饲料中钙磷含量, 以及两者之间的比例对于维持体壁结构起重要作用[27]。为了保证蜕壳的顺利完成, 甲壳动物会在蜕壳期储存磷, 这些磷主要来源于肝胰腺和血淋巴, 饲料中磷的缺乏会造成蜕壳延缓或蜕壳不遂,最终导致生长受阻, 甚至死亡[28]。本实验所用矿物质配方参考Ma等[29]和Cui等[30], 且符合陈立侨等[31]对中华绒螯蟹饲料中钙磷比的研究: 当饵料中含钙量为0.5%、Ca/P比为1:1.9时, 幼蟹获得最大生长率和较高蛋白质利用率, 满足中华绒螯蟹对矿物质磷的基本需求。有学者报道, 当罗氏沼虾饲料中植酸含量超过21.45 g/kg时, 虾体总磷含量显著的降低[6]。但当南美白对虾(Litopenaeu vannamei)饲料中添加2000 U/kg植酸酶时, 磷的消化率由37%有效提高至47%[32]。植酸酶还能有效降低动物体磷的排泄量,显示出效用价值[33]。饲料中的植酸会螯合矿物质磷, 而甲壳动物这类单胃动物基本无法消化植酸磷。在本研究中, 饲料中植酸酶分解植酸, 提高有效磷含量, 进而也提高了中华绒螯蟹对磷的消化利用。磷保留率由20.89%显著上升到41.29%, 有效降低了元素的损失率。

有研究指出, 植物蛋白源替代鱼粉可能会损失更多的氮元素, 当水生动物摄食氨基酸不平衡的饲料, 会分解不能利用的氨基酸, 导致的过多排泄[34]。水体中氨氮大部分来源于动物体自身排泄, 若氨氮含量过高, 非离子氨会通过鳃渗入血液, 对动物体产生毒害作用, 致使代谢异常,甚至死亡[35]。本实验结果表明, 由于植酸螯合物的不可消化性, 中华绒螯蟹在摄入氮元素相同的情况下, 植酸添加组中华绒螯蟹的氮保留率较低。而在添加植酸酶后, 饲料中氮物质的利用得以提高, 蟹体氮保留率由18.47%显著上升至25.78%。提示植酸酶能够有效消除植酸对氮营养物质的结合作用, 促使植酸释放出一些氨基酸、以及大分子蛋白质物质, 供给动物体有效消化吸收和利用, 从而降低饲料氮的排泄, 这对于养殖水环境的保护也是有益的[10]。