草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因的克隆和表达分析

赵 威 徐豪芒 郑建波 贾永义 顾志敏 罗 琛

(1. 浙江大学生命科学学院, 杭州 310058; 2. 浙江省淡水水产研究所, 湖州 313001)

成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor, FGFRs)是一类能将FGF信号传递到细胞质中的跨膜酪氨酸激酶受体。它们通过调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡[1]而在血管形成[2,3]、骨骼发育[4—8]、组织损伤修复和愈合[9,10]以及肿瘤发生[11,12]等过程中起重要作用。目前研究最深入的FGFRs因子包括Fgfr1、Fgfr2、Fgfr3和Fgfr4。它们都包含胞外区、跨膜区和胞内区3个部分。胞外区为配体识别和结合区, 其中有3个免疫球蛋白样结构域(Ig-Ⅰ、Ig-Ⅱ和Ig-Ⅲ), 跨膜区为穿过细胞膜的疏水性螺旋区段, 细胞内区为酪氨酸激酶区[13]。FGFR通过辅助因子硫酸乙酰肝素(Heparansulfate, HS)的介导[14,15], 与配体FGF结合来启动FGFRs胞内酪氨酸磷酸化。然后, 可激活不同胞内信号通路的激酶, 如促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase, MAPK), 磷脂酰肌醇3-激酶-Akt [Phosphoinositide 3-kinase(PI3K)-AKT,PI3K-Akt]和磷脂酶Cγ/Ca2+(Phospholipase Cγ/Ca2+,PLCγ/Ca2+)[16,17]等, 而产生多种不同的生物学效应。近年来发现了1种FGFR受体类似物Fgfrl1。这种类FGFR受体缺乏胞内酪氨酸激酶结构域, 能与FGFs结合但不能介导FGF信号。因此, 能与其他FGFR受体竞争结合FGF配体而起抑制FGF信号的作用[18]。

近年对鲤(Cyprinus carpio)基因组序列进行的生物信息学分析发现了一个成纤维细胞生长因子受体同源类似物1(fibroblast growth factor receptor homolog 1-like,fgfrhl-1, XM_016294026.1)序列。该fgfrhl-1的基因组序列与鲤的其他fgfr基因组序列差异显著。但根据编码区碱基序列预测的蛋白结构与典型的FGFR家族成员结构类似, 也具有胞内酪氨酸激酶区、跨膜结构区以及胞外配体识别结合区, 但Fgfrhl-1的胞外区缺失3个免疫球蛋白样结构域。随后在斑马鱼、金鱼、红肚水虎等鱼类基因组中也发现了fgfrhl-1序列。有趣的是不同鱼类中fgfrhl-1的基因组序列高度保守, 但在鱼类以外的其他脊椎动物物种基因组中尚未发现其同源基因组序列。fgfrhl-1在鱼类中的这种独特性和进化保守性, 提示其可能在鱼类中具有某种独特而重要的生物学功能。但目前尚无有关fgfrhl-1基因克隆和表达分析证明其是功能基因的研究报道。因此, 我们选择在亲缘关系较远的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和翘嘴鲌(Culter alburnusBasilewsky)中克隆了fgfrhl-1的cDNA, 并通过半定量RT-PCR和冰冻切片原位杂交分析了该基因在成体草鱼和翘嘴鲌多种组织中的表达情况, 以为深入研究fgfrhl-1在鱼类中的功能和判断其育种价值提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

本研究所用的成年草鱼购自杭州三墩镇温州村菜市场, 翘嘴鲌取自湖州淡水研究所养殖基地。适量的活体草鱼肌肉、肌间隔、肝脏、脾、心脏、鳃、尾鳍和翘嘴鲌肌肉、肌间隔、肝脏、肾、脑、脾、心脏、尾鳍组织等样品分别于液氮中快速冷冻处理后, 保存在-80 ℃冰箱, 用于后续RNA和基因组DNA提取。肌间隔的结缔组织呈白色, 容易在体视显微镜下与肌肉纤维剥离。其他组织和器官的结缔组织与间质组织不容易分离, 因此未分开取样。Ex-Taq酶、pMD18-T克隆载体试剂盒购自TaKaRa 公司, Total RNA Extractor试剂盒购自生工生物工程股份有限公司, TURBO DNA free kit试剂盒购自ambion公司, HiFiScript cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒购自康为公司, SMARTerTMRACE试剂盒购自ClonTech公司, 胶回收试剂盒购自Axygen公司, DIG RNA Labeling Mix购自Roche公司, 实验中所用引物皆委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 Total RNA的提取及cDNA第一链合成

基因组DNA使用酚氯仿法从草鱼和翘嘴鲌尾鳍组织中提取。各组织Total RNA按照Total RNA Extractor试剂盒说明书步骤提取。为避免基因组DNA污染, 所提取的Total RNA都使用TURBO DNA free kit试剂盒进行消化处理。最后将提取的所有核酸产物通过琼脂糖电泳检测和浓度测定, 选择无污染的核酸产物用于后续实验。以提取的Total RNA为模板, 使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA的第一条链。具体操作按照试剂盒说明书步骤进行。

表1 用于草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因克隆、表达分析的引物Tab. 1 Primers used for cloning and expression of fgfrhl-1 in Ctenopharyngodon idellus and Culter alburnus

1.3 全长fgfrhl-1 cDNA的克隆

通过比较GenBank中预测的多种鲤科鱼类fgfrhl-1 mRNA序列, 筛选出保守序列, 再根据该序列设计引物fgfrhl-S1和fgfrhl-AS1 (表 1)。PCR的反应体系为50 μL, 成分包含10×Ex-TaqBuffer 5 μL、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μL、正反向引物(2.5 μmol/L)各4 μL、cDNA 2.5 μL,Ex-Taq0.5 μL及补足ddH2O至50 μL。扩增条件: 预变性94 ℃, 5min; 变性94 ℃, 30s, 退火50 ℃, 30s, 延伸72 ℃, 60s(32个循环); 延伸7min结束反应。PCR产物经胶回收后连接至pMD18-T克隆载体送上海生工测序, 测序结果使用NCBI网站中的Blast功能进行序列比对后确认其为目的片段。然后根据已获得编码区序列分别设计正反向特异性巢式引物c/e-5′RACEAS1、c/e-5′RACEAS2和c/e-3′RACES1, c/e-3′RACES2 (表 1),其中c表示草鱼RACE引物, e表示翘嘴鲌RACE引物。参照SMARTerTMRACE试剂盒的说明书进行cDNA末端扩增。最终获得草鱼和翘嘴鲌fhfrhl-1基因的cDNA全长。再根据cDNA全长在5′端上游和3′端下游分别设计引物c/e-LS-S1和c/e-LS-AS1 (表 1)进行连锁分析。最终将PCR产物测序结果经Blast序列对比来确定所得到的草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1全长cDNA序列的正确性。

1.4 氨基酸序列预测、比对及进化树分析

使用Primer Premier 5软件推测出草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因编码的氨基酸序列, 用DNAMAN软件将推测的氨基酸序列结果比对进行同源性分析,随后使用MEGA 7.0软件的Neighbor-joining方法构建了系统进化树。利用在线软件SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)进行了蛋白质二级结构预测。

1.5 fgfrhl-1在草鱼和翘嘴鲌成体不同组织和器官中表达分析

测定所提草鱼和翘嘴鲌RNA的浓度, 各组织取1 μg Total RNA为模板, 使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录得到cDNA。用Jellyfish软件比对草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1编码区序列(CDS), 发现两者CDS十分保守, 只需设计一对跨内含子引物semi-S1, semi-AS1 (表 1)来做两者半定量PCR。跨内含子引物参考斑马鱼fgfrhl-1基因内含子结构位置设计。半定量PCR内参基因用β-actin基因, 引物序列为β-actinS: 5′-TCACACCTTCTACAACGAG CTGCG-3′,β-actinAS: 5′-GAAGCTGTAGCC TCTCTCGGTCAG-3′, 取逆转录cDNA各1 μL为模板。反应体系为10 μL: 2×Ex-Taqmix 5 μL, semi-s1 1 μL, semi-as1 1 μL, cDNA 1 μL, 水2 μL。循环参数为95℃ 1min; 98℃ 10s, 55℃ 30s, 72℃ 30s (3个循环); 98℃ 10s, 53℃ 30s, 72℃ 30s (32个循环); 72℃7min。

根据草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA中的CDS序列, 设计合成原位杂交探针所需要的引物probe-S1,probe-AS1 (表 1)。以草鱼和翘嘴鲌肌间隔组织cDNA为模板进行PCR, 将900 bp的目的片段与pBluescriptⅡ SK(+/-)质粒连接构建重组载体并测序。然后合成地高辛标记的反义和正义探针(阴性对照探针), 具体操作按照Roche公司DIG RNA Labeling Mix说明书进行。取新鲜成年活体草鱼和翘嘴鲌小块肌肉、肝脏和脾脏组织进行冰冻切片, 切片厚度12 μm。原位杂交步骤参照本实验室冰冻切片原位杂交说明书进行, 在实验过程中做了适当的修改。过程包含: 4%的多聚甲醛(PFA)固定切片30min, DEPC处理过的磷酸缓冲液(DEPC-PBS)复水后蛋白酶K消化15min, PBS漂洗后用三乙醇胺(TEA)对切片组织酸化处理, 室温预杂交2h后用含地高辛标记探针的杂交液55 ℃杂交12—16h。柠檬酸钠缓冲液漂洗切片后用含羊血清的封闭液室温封闭2h, 随后用含抗地高辛抗体的封闭液4℃过夜孵育切片组织。洗脱抗体后, 在显色液NBT/BCIP作用下, 3—12h后观察原位杂交信号。

2 结果

2.1 草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1全长cDNA的结构

用fgfrhl-S1和fgfrhl-AS1引物通过RT-PCR方法在草鱼和翘嘴鲌肌肉组织RNA中都扩增到了一段长度为700 bp的核苷酸片段。对该序列测序并通过NCBI网站中Blast功能进行序列分析的结果显示其都与鲤鱼预测fgfrhl-1序列高度同源, 与fgfr的同源序列差异较大。因此, 可以确定所获得的扩增产物分别为草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA的序列片段。

随后用SMARTerTMRACE试剂盒通过5′-RACE和3′-RACE扩增草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA的5′和3′末端序列, 分别在草鱼中获得了长度为976 bp的上游单一产物和长度为795 bp的下游单一产物; 在翘嘴鲌中获得了长度为741 bp的上游单一产物和长度为958 bp的下游单一产物。通过用特异性引物对5′端上游和3′端下游序列的连锁分析, 确定了在草鱼和翘嘴鲌中所获得的上、下游序列都是连锁的fgfrhl-1 cDNA序列。草鱼fgfrhl-1 cDNA序列全长为1472 bp, 包含5′-UTR 213 bp、3′-UTR 56 bp和开放阅读框(ORF)1203 bp, 编码400个氨基酸; 翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA序列全长为1886 bp, 包含5′-UTR 298 bp、3′-UTR 385 bp和开放阅读框1203 bp, 编码400个氨基酸。序列提交至GenBank (登录号: MH817443和MH817444)。

2.2 草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1氨基酸序列比对和蛋白结构预测

将Primer Premier 5软件推测出的草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1氨基酸序列运用DNAMAN软件进行了同源比对分析, 结果显示草鱼与翘嘴鲌的Fgfrhl-1氨基酸序列同源性为95.5%, 其酪氨酸激酶区高度保守。利用在线软件SMART(http://smart.emblheidelberg.de)对草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1的蛋白质二级结构进行了分析。结果显示草鱼和翘嘴鲌的Fgfrhl-1的蛋白质也都具有胞外区、跨膜螺旋区和胞内酪氨酸激酶区。但两者胞外区均只有19个氨基酸, 缺少3个免疫球蛋白样结构域。这说明两者Fgfrhl-1的胞外区的受体功能相同, 但与其他FGFR的受体功能显著不同。

2.3 不同物种fgfrhl-1基因氨基酸聚类分析

从GenBank数据库中下载了根据基因组序列预测而来的下列不同鱼类的Fgfrhl-1氨基酸序列:包括鲤科中的抚仙金线鲃(XP_016149512.1)、安水金线鲃(XP_016335374.1)、斑马鱼(XP_693602.5)和红肚水虎(XP_017550332.1), 鲱科中的大西洋鲱(XP_012679480.1), 鲑科中的银大麻哈鱼(XP_0203 59383.1)、太平洋帝王鲑(XP_024289814.1)、虹鳟(XP_021478795.1)、大西洋鲑(XP_014019092.1)和红点鲑(XP_023869192.1), 骨舌鱼科中的美丽硬仆骨舌鱼(XP_018603961.1), 象鼻鱼科中的副长颌鱼(XP_023701156.1), 脂鲤科中的墨西哥脂鲤(XP_022537012.1)。利用MEGA 7.0软件的邻接法(Neighbor-joining)对草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1氨基酸序列与其他鱼类的Fgfrhl-1氨基酸序列构建了系统进化树(图 1)。从图中可以看出, 草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1与金线鲃和斑马鱼Fgfrhl-1的亲缘关系最近,其次是红肚水虎和大西洋鲱, 与太平洋帝王鲑和虹鳟关系相对较远。这种Fgfrhl-1的系统进化关系与传统分类中这些物种的亲缘关系基本一致。

2.4 草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因在成体组织中的表达

为了检测fgfrhl-1基因在草鱼和翘嘴鲌成体组织中的表达, 我们在参考斑马鱼fgfrhl-1基因内含子结构位置后设计了fgfrhl-1基因跨第五内含子引物。用草鱼和翘嘴鲌基因组DNA为模版进行PCR扩增, 分别获得900 bp左右和750 bp左右的产物, 而用cDNA作为模板扩增得到的产物长度为200 bp,说明该引物确实是跨草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1基因的第五内含子。半定量RT-PCR结果显示fgfrhl-1在草鱼肌间隔、脾、肝、尾鳍、鳃和心脏中均有表达;在肌肉纤维中难以检测到表达。翘嘴鲌中的表达情况与草鱼中相同。fgfrhl-1在肌间隔、脾、肝、肾、脑和心脏中均有表达, 肌肉纤维中基本不表达(图 2)。

图1 采用Neighbor Joining方法构建的不同物种Fgfrhl-1蛋白系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of Fgfrhl-1 protein generated with Neighbor Joining method

图2 fgfrhl-1基因在成体草鱼和翘嘴鲌不同组织中的表达Fig. 2 The expression level of fgfrhl-1 in various tissues of adult grass carp and C. alburnus

为直观地证明fgfrhl-1基因在肌肉组织不同结构中的表达差异, 我们取草鱼和翘嘴鲌成体肌肉组织进行了冰冻切片和mRNA原位杂交分析。结果表明在成年草鱼和翘嘴鲌的肌肉组织里, 都只在肌隔中检测到了fgfrhl-1 mRNA的杂交信号, 在肌肉纤维中没有可确认的杂交信号(图 3a、3b)。

鉴于fgfrhl-1基因在肌肉组织的肌隔和肌纤维中存在表达差异, 我们进一步用冰冻切片原位杂交技术检测了草鱼和翘嘴鲌肝脏和脾脏中该基因是否也存在组织特异性表达。结果表明在这两种鱼类的肝脏和脾脏中,fgfrhl-1都只在结缔组织结构中表达, 在间质细胞组成的结构中没有表达(图 4)。

3 讨论

本研究利用RT-PCR、RACE等分子克隆方法获得草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1全长cDNA。草鱼和翘嘴鲌fgfrhl-1 cDNA的序列全长分别为1472和1886 bp,5′-UTR分别为213和298 bp, 3′-UTR分别为56和385 bp, 编码区都为1203 bp, 编码400个氨基酸。根据碱基序列预测的草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1蛋白的氨基酸序列同源性高达95.5%。根据氨基酸序列预测的Fgfrhl-1蛋白二级结构同经典的FGFRs家族蛋白一样具有胞内酪氨酸激酶区, 跨膜的螺旋区和胞外受体区, 但其胞外区比FGFRs缺少了3个免疫球蛋白样结构域。用半定量RT-PCR和组织切片原位杂交技术在草鱼和翘嘴鲌的肌间隔、心脏、鳃、肝、脾和尾鳍中均检测到了fgfrhl-1表达, 在肌肉纤维中都没有检测到其表达。组织切片原位杂交在草鱼肝脏和脾脏中也检测到fgfrhl-1在这些器官的结缔组织和导管中表达, 不在间质细胞结构中表达。这些结果说明: (1)fgfrhl-1的成体组织特异性表达模式在不同鱼类中基本一致, (2)fgfrhl-1在鱼类各组织和器官的结缔组织和导管中表达, 不在间质细胞中表达。因此, 该基因可能在鱼类结缔组织及导管分化调控或功能维持中有独特作用。

图3 fgfrhl-1基因在草鱼和翘嘴鲌肌肉组织中表达的原位杂交Fig. 3 In situ hybridization of fgfrhl-1 in muscle tissues of grass carp and C. alburnus

图4 fgfrhl-1基因在草鱼和翘嘴鲌肝脏和脾脏中表达的原位杂交Fig. 4 In situ hybridization of fgfrhl-1 in liver and spleen tissues of grass carp and C. alburnus

基因组进化的比较研究发现在基因扩增和整个基因组加倍后的重复基因进化过程中, 原始多功能基因的重复基因拷贝会通过序列突变以互补的方式分享其原始基因的功能或者产生具有新功能的基因[19,20]。在fgfr基因进化过程中, Fgfrhl-1丢失了胞内酪氨酸激酶受体区, 能与FGF配体结合但不能介导FGF信号。其生物学功能是与其他FGFR受体竞争FGFs配体而起抑制FGF信号传递的作用[18]。草鱼和翘嘴鲌Fgfrhl-1虽然仍保留了FGFR受体的胞外区, 跨膜区和胞内区三个基本二级结构域, 但其氨基酸序列与经典的FGFRs有显著差别。尤其在胞外配体识别结合区, 缺失了典型FGFRs所具有的3个免疫球蛋白样结构域。因此, Fgfrhl-1的配体识别和结合功能, 以及信号传导功能都会与典型FGFR受体有差别。Fgfrhl-1的胞外区如何识别和结合配体, 以及在信号传导途径中起什么作用都有待进一步的研究来回答。

与其他脊椎动物不同, 真骨鱼类的肌肉组织中独有刺状肌间小骨(Intermuscular bone)。已有的研究认为这种肌间刺是由肌隔结缔组织通过膜性骨化发育而来的[21,22]。有趣的是, 在本实验中我们发现鱼类中独有的fgfrhl-1基因在成年草鱼和翘嘴鲌肌间隔组织中有明显表达, 在肌肉纤维中不表达。已有的研究证明了FGFR是调控骨骼发育的重要因子。在脊椎动物骨骼发育过程中, 首先是间充质细胞分化为前体成骨细胞, 随后成骨细胞发育为成熟骨细胞。Fgfr1和Fgfr2能维持间充质细胞的多能性而防止细胞衰老[23]。这两个基因的突变可促进成骨细胞分化和膜内成骨过程, 从而导致颅缝提前闭合[24,25], 提示其具有防止骨发生的作用。Fgfr3则能抑制软骨形成, 是骨骼发育的负性调节分子。fgfr3基因敲除的小鼠中小鼠骨骼出现过度生长[26]。Fgfrl-1也被证明在鱼类中在鳃软骨发育调控中起重要作用[27,28]。Fgfrhl-1是否与这些典型FGFR因子协同或拮抗而在鱼类肌隔结缔组织膜性骨化中起作用需要进一步研究。