鲤sPLA2-III基因结构、系统发育和表达特征

2019-11-26许迪辉李红霞李建林唐永凯磊沈泽恩俞菊华

水生生物学报 2019年6期

许迪辉李红霞, 李建林, 唐永凯, 王钦张磊沈泽恩俞菊华,

(1. 南京农业大学无锡渔业学院, 无锡 214128; 2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室, 无锡 214128)

磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)是一种水解磷脂二位酰基(sn-2)生成非酯化脂肪酸和溶血磷脂的酶[1], 广泛存在于动植物体内。PLA2在生物体内发挥多种生理功能, 如膜磷脂的降解和代谢、信号传导、宿主防御等[2]。PLA2可分为分泌型PLA2(sPLA2)、胞浆型PLA2(cPLA2)、非钙依赖型PLA2(iPLA2)、血小板活化因子乙酰水解酶(PAFAH)和溶酶体型PLA2(LPLA2)等[3]。其中, 分泌型PLA2(sPLA2)是PLA2中最大的亚家族, 是导致炎性脂质介质产生的关键分子[4]。sPLA2在中心结构域上均含有偶数个半胱氨酸, 可形成二硫键, 对稳定和保持蛋白空间三维结构起着重要作用[5]。

在sPLA2家族中, sPLA2-III(sPLA2group III)蛋白分子量为55 kD, 远大于其他亚型, 由10个半胱氨酸构成5个二硫键稳定结构[1,6]。蜂毒sPLA2-III只有中心结构域(Centre sPLA2domain): 3个α螺旋、2个β折叠、1个Ca2+结合环。人sPLA2-III则除了中心结构域外还有独特的N端(N-terminus)和C端(C-terminus), 与其他哺乳动物相比, 人sPLA2-III的中心结构域与蜂毒的同源性更高[6]。

哺乳动物sPLA2-III由多种细胞分泌, 尤其是附睾上皮细胞[7]、神经元[8]、微血管的上皮组织细胞以及肿瘤细胞[9]有高表达。该基因具有多种生理功能。Sato等[7]发现, sPLA2-III在小鼠睾丸组织中呈现高表达, 该基因与小鼠精子获能、精子运动能力、顶体反应等有关, 该基因缺失导致精子发育不良和弱精症[10]。转染sPLA2-III小鼠的低密度脂蛋白(Low-Density Lipoprotein, LDL)降低, 而小致密低密度脂蛋白(Small dense Low-Density Lipoprotein, sd LDL)上升, 后者能够诱导巨噬细胞泡沫化,导致动脉粥样硬化(Atherosis, AS), 在人类和apoE缺陷小鼠的动脉粥样硬化病变组织中也检测到了sPLA2-III, 显示sPLA2-III有促AS作用[11,12]。sPLA2-III在肿瘤细胞中也有异常表达, 转染sPLA2-III的结肠癌裸鼠与正常结肠癌裸鼠对照发现, 前者形成更大的实体瘤, 用小干扰RNA(Small interfering RNA)干扰sPLA2-III的表达后可降低肿瘤细胞增殖, 表明该基因在肿瘤病变、细胞增殖中发挥着重要作用[13]。

sPLA2-III最先在蜂毒和一些蜥蜴中发现, 随后,该基因在水母、海洋螺类以及蝎子中陆续发现[6],推测sPLA2-III是在脊椎动物和无脊椎动物分化之前就存在的原始基因[14]。连接脊椎动物和无脊椎动物的鱼类, 在进化史中具有重要地位, 但至今对鱼类sPLA2-III的研究报道不多, 仅在基因库中能获得一些主要研究鱼类的sPLA2-III序列。鲤(Cyprinus carpioLinnaeus)是重要的经济淡水鱼类之一,也是典型的异源四倍体, 是研究重复基因进化的好材料。本实验挖掘了鲤sPLA2-III成员, 分析了序列的保守性、进行了2R (Two rounds of genome duplication)和3R (Fish-specific genome duplication or 3R)鱼类[15]sPLA2-III基因成员的系统发育和线性分析, 揭示了它们的时空表达模式, 并为今后进一步揭示其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验鲤及鲤早期胚胎样品均来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地, 实验鲤为当年人工繁殖的同池养殖鱼种, 平均体重70 g, 体长10—15 cm。

1.2 实验试剂与仪器

总RNA提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。逆转录试剂盒[Prime ScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)]、SYBR®Premix ExTaqIITM等购自TaKaRa生物(大连)有限公司。PCR仪、紫外分光光度计等仪器购自德国Eppendorf公司。荧光定量PCR仪为TaKaRa TP800型的实时荧光定量PCR仪。

1.3 实验引物

通过Blast和线性分析在鲤全基因组中获得五个sPLA2-III基因序列。P1-P2、P3-P4、P5-P6、P7-P8、P9-P10分别用于Ccpla2g3a1、Ccpla2g3a2、Ccpla2g3b、Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c2的序列验证,并上传基因库, 获得序列号。根据获得序列设计特异性引物P11-P12、P13-P14、P15-P16、P17-P18测定样品Ccpla2g3a1/2、Ccpla2g3b、Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c2的表达, 由于Ccpla2g3a1和3a2 cDNA序列一致性较高, 这里共用一对引物。引物P19-P20为内参β-actin的定量引物。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成(表 1)。

1.4 鲤早期胚胎样品

鲤受精卵在水温22℃的孵化箱中孵育, 收集受精0.5h (胚盘出现)、12h (原肠中期)、25h (肌节出现)、35h (脑泡出现)、60h (心脏、眼点出现)、120h (即将破膜)的受精卵[16,17], 并保存于RNA sample protector中。

1.5 鲤组织样品

鲤雌、雄各三条(平均体重70 g), 麻醉后, 采集心、肝、脾、体肾、头肾、肠、脑、鳃和性腺9个组织, 于-80℃冰箱保存。

1.6 生物信息学分析

鲤sPLA2-III基因所在连锁群信息来自NCBI,雀鳝(Lepisosteusoculatus)、斑马鱼(Danio rerio)、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)等鱼类的sPLA2-III线性分析使用Genomicus (v87.01)[18], 序列在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得, 得到的cDNA序列采用ORF (Open reading frame)finder寻找正确的开放阅读框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。使用MatGAT软件[19]分析鲤及其他鱼类sPLA2-III氨基酸序列的相似性和一致性[20]。在MEGA 7.0软件[21]中进行鲤及其他鱼类sPLA2-III多序列比对, 比对结果用邻接法, 以1000次自检率构建N-J系统进化树。

使用FancyGene[22]绘制基因结构示意图。使用protparam在线工具对鲤sPLA2-III基因的相关理化性质进行预测分析(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam), SignalP 4.1 (version 4.1)在线工具[23](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽。

表1 序列验证和qPCR所用引物Tab. 1 Primers used for sequences and qPCR

1.7 RNA提取、逆转录及实时荧光定量PCR

使用总RNA提取试剂盒提取RNA, 测定OD值,OD值在1.8—2.0, 并于1%琼脂糖凝胶电泳, 检测RNA完整性。

逆转录: 采用Prime ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行操作, 所得cDNA于-20℃保存。

获得的cDNA用实时荧光定量PCR(qPCR)法分别检测Ccpla2g3as、Ccpla2g3b、Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c1在鲤受精0.5h、12h、25h、35h、60h、120h以及不同组织心、肝、脾、体肾、头肾、肠、脑、鳃、性腺组织中的相对β-actin表达水平。过程参照TaKaRa公司生产的SYBR®Premix ExTaqIITM试剂盒说明书。

实验结果采用2-ΔΔCt法[25]进行计算, 鲤早期胚胎不同发育阶段和各组织的相对表达量分别使用SPSS 20.0软件中的Turkey多重比较法和T检验进行差异显著性分析,P＜0.05为差异显著,P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 鲤sPLA2-III基因序列

鲤sPLA2-III基因序列特征通过同源搜索,在NCBI中挖掘到5个鲤sPLA2-III类似基因, 分别位于LHQP01025954、LHQP010113959、LHQP01 028027、LHQP01026208、LHQP01015502连锁群,命名为Ccpla2g3a1、Ccpla2g3a2、Ccpla2g3b、Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c2[25]。氨基酸命名同样参照文献[24]。除了LHQP01028027上的Ccpla2g3b外,其余4个PCR验证结果除了个别碱基存在差异外,序列基本一致, LHQP01028027上的Ccpla2g3b由于碱基缺失, 导致提前终止, 阅读框比克隆到的基因短很多。克隆的基因已上传基因库, 登录号分别为: KF793833、KF793834、MH990666、MH99 0664和MH990665。

序列分析表明:Ccpla2g3a1和Ccpla2g3a2由7个外显子和6个内含子组成,Ccpla2g3a1外显子1和外显子4分别比Ccpla2g3a2多9和6 bp。开放阅读框(ORF)分别为1593和1578 bp, 分别编码530和525个氨基酸。均含有22个氨基酸组成的信号肽,成熟肽分子量分别为57.69和57.72 kD, 等电点(pI)分别为8.00和7.82。成熟肽由N端、sPLA2中心结构域(Ccpla2g3a1为141个氨基酸,Ccpla2g3a2为140个氨基酸)和C端组成。

Ccpla2g3b由4个外显子和3个内含子组成, 外显子长度分别为520、133、135和598 bp。开放阅读框1386 bp, 编码461个氨基酸。有27个氨基酸组成的信号肽, 成熟肽分子量为49.78 kD, 等电点为9.97。成熟肽由N端、141个氨基酸组成的中心结构域和C端组成。

Ccpla2g3c1和Ccpla2g3c2均有4个外显子和3个内含子, 除外显子4相差3 bp外, 其余3个外显子长度均相同。开放阅读框分别为2259和2262 bp, 分别编码752和753个氨基酸。均含有19个氨基酸组成的信号肽, 成熟肽分子量分别为82.18和82.33 kD, 等电点分别为9.17和9.20。成熟肽由N端、141个氨基酸组成的中心结构域和C端组成。图 1为各基因的结构简图, 表 2为蛋白结构比较。

图1 鲤sPLA2-III基因结构示意图Fig. 1 Schematic diagram of sPLA2 group III gene structure in common carp

表2 鲤sPLA2-III结构域比较Tab. 2 sPLA2 group III domains in common carp

表3 鲤sPLA2-III与其他鱼类sPLA2-III的氨基酸的一致性和相似性百分比(右上角, 一致性; 左下角, 相似性)Tab. 3 The similarity of amino acid identity of CcsPLA2-III and other fish sPLA2-III (upper triangle, identity; lower triangle, similarity)

sPLA2-III氨基酸序列比对通过Mat-GAT软件对鲤与其他鱼类sPLA2-III氨基酸序列进行相似性和一致性分析。结果显示(表 3),CcPla 2g3cs之间的相似性(97.6%)和一致性(96.1%)最高,CcPla2g3as之间的相似性(93.2%)和一致性(89.4.%)次之, 但鲤sPLA2-III家族旁基因之间的相似性都较低(33.5%—46.4%)。与其他鱼类相比, 同为鲤科鱼的鲤和斑马鱼sPLA2-III的垂直同源基因之间相似性和一致性均最高, Pla2g3a之间相似性分别为85.1%和85.4%, 一致性分别为75.2%和75.6%;Pla2g3b之间相似性为74.3%, 一致性为56.5%;Pla2g3c之间相似性分别为85.1%和84.1%, 一致性分别为77.0%和76.5%。鲤与其他目的垂直同源基因之间的相似性和一致性普遍较低。

鱼类sPLA2-III系统发育分析将鲤及其他鱼类的同源序列采用Mega 7.0软件构建N-J系统进化树(图 2)。结果表明整个进化树分成三个分支,所有鱼类的Pla2g3as以95%置信度聚为一小支, 除鲤科鱼之外的Pla2g3b以99%置信度聚为一小支, 这两小支以96%置信度聚为完整的一支。CcPla2g3b与斑马鱼Pla2g3b单独形成一大支。所有鱼类的Pla2g3cs又以100%置信度聚为完整的一支。可以看出, Pla2g3as与Pla2g3bs先聚为一支, 最后与Pla2g3cs聚为一支, 共同形成鱼类sPLA2-III的系统进化树。

鱼类sPLA2-III线性分析通过Genomicus(v87.01)进行雀鳝、斑马鱼、三刺鱼、青鳉(Oryzias latipes)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、亚马逊帆鱼(Poecilia formosa)sPLA2-III的线性分析。

分析发现(图 3), 雀鳝(2R鱼)中只有一个pla2g3a(b)基因, 其上游基因为ptpn11a(Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type11, a)和RPH3A(Rabphilin 3A), 下游基因为tbx5a(T-box 5a)。雀鳝经TGD (Teleost genome duplication, 又称为3R)染色体加倍后, 硬骨鱼类(3R鱼)中出现了位于两相似连锁群上的pla2g3a与pla2g3b两个不同的基因。ptpn11a和RPH3A都保守的存在于3R鱼pla2g3a的上游, 而雀鳝下游基因tbx5a没有发现。RPH3A的同源基因rap3ab[Rabphilin 3A homolog (mouse) b]仍保守地存在于3R鱼pla2g3b的上游。pla2g3a在鲤中存在着Ccpla2g3a1与Ccpla2g3a2的两个旁基因,RPH3A保守地存在于目的基因上游。Ccpla2g3b目前只在鲤的染色体LG1上发现了一个, 3R鱼的HECTD4 (HECT domain E3 ubiquitin protein ligase 4)保守地存在于Ccpla2g3b下游。

图2 鱼类sPLA2-III成员系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of fish sPLA2 group III

雀鳝pla2g3c的上游基因为rab34a(RAB34,member RAS oncogene family b)和aptl(Adenine phosphoribosyltransferase-like), 下游基因为supt6h(SPT6 homolog, histone chaperone)和sdf2 (Stromal cell-derived factor2)。经TGD后, 在3R鱼中存在2个相似的连锁群, 其中一个连锁群上有pla2g3c, 除了三刺鱼中aptl丢失,rab34a和2个基因仍保守的存在于3R鱼pla2g3c的上游, 但雀鳝下游的supt6h和sdf2没出现。在TGD过程中3R鱼另一个pla2g3c基因已经丢失, 但是雀鳝上游基因的同源基因rab34b以及下游基因supt6h和sdf2在3R鱼另一连锁群上中比较保守。鲤经特异基因组复制,也发现了2个不同的Ccpla2g3cs基因, 其中,Ccpla2g3c1两侧基因与斑马鱼一致,Ccpla2g3c2的上游只发现了rab34a基因。

2.2 鲤sPLA2-III基因表达

鲤sPLA2-III基因在胚胎发育阶段表达荧光定量PCR分别检测了鲤sPLA2-III各基因分别在受精后0.5h、12h、25h、35h、60h、120h的表达变化。结果显示(图 4),Ccpla2g3as在鲤整个早期胚胎阶段的表达量均较低。Ccpla2g3as在受精0.5h的表达量显著高于25h和60h (P＜0.05)。Ccpla2g3b在0.5h表达量最高, 显著高于12h和120h (P＜0.05), 极显著高于25h、35h、60h (P＜0.01), 于25h降到最低(P＜0.01)。Ccpla2g3c1在0.5—60h期间表达量均较低, 120h表达量极显著升高(P＜0.01)。Ccpla2g3c2在0.5h至60h期间(除12h)表达量较低, 于120h表达量极显著升高(P＜0.01), 120h的表达量显著高于12h(P＜0.05)。

鲤sPLA2-III基因在不同组织表达荧光定量PCR结果显示,Ccpla2g3as在肝脏中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01)。Ccpla2g3b在卵巢中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01); 精巢中的表达量显著高于肝脏和肌肉(P＜0.05), 极显著高于其余组织(P＜0.01); 卵巢中Ccpla2g3b极显著高于精巢(P＜0.01)。Ccpla2g3c1在脑中的表达量最高(P＜0.01), 其他组织中表达量较低。Ccpla2g3c2在脑中表达量极显著高于其他组织(P＜0.01), 肠的表达量极显著高于其余组织(P＜0.01, 图 5)。

图3 硬骨鱼类及其祖先sPLA2-III共线性分析示意图Fig. 3 Schematic diagram of synteny of sPLA2 group III in teleost’s and their ancestors

3 讨论

3.1 鲤sPLA2-III基因

本文使用同源搜索在鲤基因组挖掘到了5个具有PLA2_bee_venom_like region的Ccpla2g3基因, 线性分析发现其中Ccpla2g3c是人PROCA1基因的同源基因, 追溯在人中定名为PROCA1的原因是其与cyclin A1能相互作用[26]。最初登录为部分序列(登录号: AAT09159), 但该序列在cDNA文库中并没有被找到, 目前该序列已被更正为Q8NCQ7。该序列也存在PLA2_bee_venom_like region结构域, 但与人PLA2G3中的PLA2_bee_venom_like region差异较大, 与文章中的序列比较发现存在较大的差异, 没有文献[25]中确定的与cyclin A1作用的特征序列,人PROCA1基因在睾丸呈高表达。鉴于鱼类PROCA1基因是否能与cyclin A1相互作用还没有确认, 且其表达也与人的存在差异, 加之含有保守的PLA2_bee_venom_like region, 因此, 这里把该基因归为sPLA2-III亚家族, 定名为Ccpla2g3c。5个Ccpla2g3s都由信号肽、中心结构域、较长的C端和N端组成, 且中心结构域中均存在10个半胱氨酸,可形成5对二硫键, 具有保守的sPLA2-III特征序列[1],表明本文挖掘到的是sPLA2-III亚家族成员。

5个Ccpla2g3s基因位于独立的连锁群上, 而二倍体硬骨鱼类如斑马鱼、青鳉等在基因组中均存在3个pla2g3基因:pla2g3a、pla2g3b、pla2g3c基因, 表明鲤是四倍体鱼[26]。鱼类pla2g3s基因的同源性、系统发育和线性分析结果支持: 雀鳝(2R鱼)中pla2g3a(b)经过3R过程, 在3R鱼中形成了pla2g3a和pla2g3b两个不同的基因, 但鲤科鱼类在进化过程中pla2g3b变异较大而单独成了一支, 最明显的变异是鲤和斑马鱼的pla2g3b只有4个外显子, 而其他鱼类则和pla2g3a类似, 有7-8个外显子; 3R鱼中只挖掘到1个pla2g3c基因, 是由于其中1个染色体上丢失了1个pla2g3c。以上说明染色体加倍过程中基因突变现象比较普遍, 但具体机理值得深入研究揭示。

硬骨鱼类及其祖先雀鳝(2R鱼)中均存在sPLA2-III, 表明sPLA2-III是一类古老的基因, 雀鳝与硬骨鱼类分离时间发生在3.5亿年前[15], 在进化过程中基因发生了较大的变异, 导致染色体上sPLA2-III的下游基因不同。相比之下, 鲤与斑马鱼分化发生在1.28亿年前, 且鲤特异的基因组复制发生在820万年前[27], 不论在染色体水平还是基因同源性, 一致性都比较高, 显示染色体、基因的突变概率是很低的。

图4 鲤sPLA2-III在胚胎发育阶段的表达Fig. 4 The relative expression of sPLA2 group III genes during embryo development of common carp early

3.2 鲤sPLA2-III基因表达特征

sPLA2-III参与磷脂的降解和代谢[2], 存在于各组织器官中, 在本实验中,Ccpla2g3as、Ccpla2g3b和Ccspla2g3cs呈现出了不同的表达模式,Ccpla2g3as在肝脏高表达, 性腺中Ccpla2g3b表达量最丰富, 而Ccspla2g3cs则在脑中有明显表达, 很好地显示了同源基因在进化过程中的表达分化; 进一步, 在鲤两个旁基因中, 表达也存在着差异, 如Ccspla2g3c2在肠中的表达水平明显高于Ccspla2g3c1 (P＜0.05) (由于不在同一图中差异标识没显示)。推测同源基因功能的分化可能最早表现在组织表达差异。Ccpla2g3s在胚胎发育过程的表达特征, 和在成鱼中的组织表达特征出现了很好的一致性,Ccpla2g3as在鲤整个受精卵阶段表达量均较低, 这可能是因为肝脏组织在受精卵阶段的发育分化不完善; 在鲤胚胎发育过程中,Ccpla2g3b在受精0.5h表达量最高, 随后呈现下降的趋势, 与该基因在性腺中的高表达量一致,表明可能与性腺脂肪代谢有密切关系, 另外推测受精卵中的高表达很可能是母源表达, 并且和小鼠sPLA2-III在性腺组织中呈高表达[7]有一致性;Ccspla2g3cs在受精120h呈现高表达, 可能与受精卵早期脑和肠道发育不完善有关, 尽管该基因是哺乳动物PROCA1的同源基因, 但和PROCA1主要在人精巢中表达不一致[28], 推测该基因功能可能存在着一定的差异。研究表明磷脂酶A2在人的炎症反应中有着重要作用[29,30], 因此, 今后有必要进一步确定Ccpla2g3s在鲤炎症中的生物学作用。