燃料乙醇生料发酵技术现状

俞建良，熊 强，张永新，刘劲松，林海龙

（国投生物科技投资有限公司，北京 100084）

生物燃料乙醇是以可再生的生物质为原料制成可作为燃料使用的乙醇，以其为代表的生物能源是关乎农业、能源、环境和区域经济的国家战略性新兴产业[1]。2017年9月，国家发展改革委、国家能源局等十五部门联合印发《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》，标志着我国生物燃料乙醇正式由试点推广进入全面推广新阶段。我国生物燃料乙醇产业的发展既面临千载难逢的历史发展机遇，也面临着来自各方的严峻挑战。通过技术创新，实现降本增效，是我国生物燃料乙醇行业不断发展壮大、有效应对国内外市场冲击的最重要途径之一。

酒精生料发酵技术，因为工艺简单、能耗低、产品得率高等原因，一直是国内外研究的热点和重点发展方向之一，本文将从决定酒精生料发酵技术能否推广应用的几个关键技术环节（粉碎预处理、生淀粉水解、发酵、染菌防治、蒸馏及DDGS 颜色）对国内外酒精生料发酵技术的研究进行综述，从而为该项技术的开发提供思路。

1 研究概况

酒精生料发酵是指在低于淀粉糊化的温度下，用生料淀粉水解酶与酵母共同作用于淀粉质原料而生产酒精的方法。与传统蒸煮法酒精生产工艺相比，生料发酵过程省去了高温蒸煮的过程，降低了能耗，减少了淀粉在高温蒸煮过程中所造成的损失（形成淀粉脂肪复合体、美拉德反应、淀粉回生等）[2]，因此可以提高淀粉酒精转化率。美国最大的生料酒精生产公司POET 的长期生产经验表明，与传统蒸煮法酒精生产工艺相比，综合能耗下降8 %～15 %，酒精得率提高12～18 kg/t 玉米。另外，生料发酵工艺简单，可有效的降低生产成本和劳动强度。因此，酒精生料发酵技术具有很高的推广和应用价值。

生料发酵技术的核心是获得高效的生料水解酶，即能在正常发酵温度下高效降解生淀粉，转化为酵母能利用的单糖。目前，已经大规模商业化的能满足生料发酵要求的生料水解酶主要有诺维信公司的Novozyme5009 和杰能科的Stargen。同时，还需要解决未经蒸煮的原料在发酵过程中容易出现的染菌问题[3]，由于生料淀粉原料颗粒度细导致的废醪液固液分离困难问题，以及残淀粉高导致的蒸馏塔易结垢、饲料颜色深等问题[4]。由于缺少可供选择的、高效的、商业化的生料水解酶，以及创新型的生产工艺，导致生料发酵技术仅在美国的POET 公司的27 个工厂以及欧洲的少数几个工厂应用，尚未在更大的范围内推广应用。

2 关键技术研究

2.1 粉碎预处理技术

由于生料发酵过程中，原料未经蒸煮，淀粉水解和发酵的温度低于淀粉糊化温度（淀粉颗粒无法膨胀破碎），因此，水解酶与淀粉颗粒的接触面积很大程度上取决于原料粉碎的颗粒度即粉碎程度。试验证明[5-6]，颗粒度越细，则越有利于淀粉的水解，进一步有利于提高酒精得率、降低醪液中的残淀粉含量。但是，粉碎过程是高能耗过程，粉碎越细，能耗越高；同时，粉碎粒度过细，不利于醪液蒸馏后的固液分离，进而影响DDGS 的加工。因此，需要权衡粉碎程度和酒精得率。POET公司普遍将玉米原料粉碎至0.5 mm 筛网通过率100 %。国内试验优化得到的最佳粉碎程度为30～40 目筛通过率100 %[6]。另外，不同类型的粉碎机由于粉碎原理不同，因此对淀粉粒的破坏程度不同，也会影响淀粉的水解效果。爱荷华州立大学的WONGSAGONSUP 等[5]用赛科龙、超级离心和锤片式粉碎机3 种粉碎机分别对玉米进行粉碎，生料发酵试验结果表明，由于赛科龙粉碎机能够破坏玉米更多的淀粉颗粒，而且粉碎粒度更小，因此经过赛科龙粉碎机粉碎的玉米，淀粉水解更充分，乙醇得率更高。

2.2 生淀粉水解技术

2.2.1 生淀粉酶

生淀粉酶一般指可以直接作用、水解或糖化未经蒸煮的淀粉颗粒的酶。因此，生淀粉酶所涉及的酶有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶等。

目前，工业上应用的生淀粉酶主要包括来源于真菌的酸性α-淀粉酶和真菌葡萄糖淀粉酶。真菌α-淀粉酶的来源相对较少，目前工业上应用的真菌α-淀粉酶几乎全部来源于丝状真菌中的曲霉属微生物，如黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等[7]。与细菌α-淀粉酶不同，大多数真菌α-淀粉酶的作用温度和pH 值都比较温和，如最适作用pH 值在5.0～5.5 之间，最适作用温度为50～55 ℃。真菌α-淀粉酶在现代淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制及生料酒精等行业已得到广泛的应用[7]。葡萄糖淀粉酶是能从非还原末端外切淀粉的α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，生成葡萄糖的酶。真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用，不同来源的糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同[8]。研究人员通过对分离纯化后的葡萄糖淀粉酶的结构解析，进一步阐释了具有生淀粉糖化酶功效的酶与水解糊化淀粉的糖化酶的不同作用机理，提出了生淀粉糖化酶中特殊的由Cp 区域和GP-Ⅰ区域构成的复合体对生淀粉有亲合吸附能力[9]。在生料水解过程中，生淀粉酶首先吸附到淀粉颗粒表面，水解产生孔洞结构，通过孔道进入淀粉颗粒内部，从淀粉颗粒内部水解淀粉，同时利用糖化酶的外切活力和淀粉酶的内切活力使淀粉粒表面及内部形成更多水解入口，并水解释放葡萄糖。生淀粉酶的水解性能是决定生料发酵技术成败的最重要因素。如果生淀粉水解能力不足，则发酵周期长、残淀粉含量高，酒精得率低；如果添加量大，成本很高，则没有应用价值。因此，开发性能高效、成本可控的生淀粉酶（配方）一直是酶制剂公司和生物燃料乙醇企业研发的方向。

目前，国际上仅有诺维信、杰能科和帝斯曼等少数几家大型酶制剂公司拥有生料淀粉酶的先进生产技术与产品，且一直处于国际领先水平[7]。美国的POET 公司的27 个燃料乙醇工厂使用了诺维信的生淀粉酶Novozyme50009 用于燃料乙醇生料发酵。由于双方签订了排他协议，该生淀粉酶未能在其他企业推广。杰能科提供了一种用于生料发酵的专用酶制剂产品，商品名为Stargen。虽然国内使用生淀粉酶Stargen001 的酒精生料发酵小试结果不错[10]，但是，由于缺少对涉及该项技术的其他应用环节的开发和掌握，目前国内生物燃料乙醇企业还没有使用该生淀粉酶进行酒精生产。国内的山东隆大生物公司也开发出了真菌α-淀粉酶的商业化产品，但是也尚未在酒精生产中应用。另外，国内相关科研院校也一直在围绕开发新的生淀粉酶开展研究工作[11-13]，希望能获得新的生物资源，大幅度提高酶活性能。

2.2.2 水解技术

（1）配料浓度

为了减少用水量，节省能源消耗，同时兼顾糖化和酒精发酵的效果，通常会将配料浓度控制在干物含量为25 %～45 %，更多地会选择30 %～35 %的范围。为了发酵能快速启动，也可以选择采用梯度配料，在发酵罐装填前期选用40%的配料浓度，而后期选用30 %的配料浓度，总体配料浓度则维持在35 %。为了抑制细菌的生长，配料时需要将pH 值调至酸性条件，一般维持在pH3～5，实际应用中一般调至pH4.2～4.5[3-4，14]。

（2）温度调控

酶法水解淀粉颗粒的初始阶段为酶与淀粉颗粒相结合，因此，颗粒淀粉水解率与初始形态、孔隙率、淀粉颗粒的粒径和表面积有关。α-淀粉酶和糖化酶的颗粒尺寸偏大，分别为几纳米，因为其相对较大的尺寸，这些酶与淀粉颗粒的结合受到限制，从而降低了颗粒淀粉的水解率。为解决该问题，需要尽量使淀粉颗粒膨胀，增加淀粉颗粒的比表面积（每单位质量的干淀粉表面面积）并破坏淀粉颗粒表面。因此，在生淀粉发酵之前，一般都会有一个较高温度的预处理水解过程。POET在专利中提到了维持半小时左右的拌料糖化工序，温度维持在25～40 ℃[4]。史永成[15]提出了一种对生淀粉进行膨胀处理的方法，优选温度在50～55 ℃条件下维持30 分钟。刘文信等[16]在玉米粉拌料过程中加入蛋白酶和淀粉酶，并调整搅拌速度为90 r/min，然后在60 ℃下维持60 min。房丹[17]研究了两阶段温度控制对生淀粉酶酶解高浓度玉米淀粉乳的影响，结果表明，与恒温反应体系相比，利用两阶段温度控制（第一阶段55～65 ℃，第二阶段65～70 ℃）明显提高了生淀粉水解的葡萄糖得率和DE值。

（3）催化因子

国内外学者研究发现，添加少量的金属离子对淀粉酶活性有显著提高，其中以二价金属离子为主。钙离子在增加α-淀粉酶酶解效率方面有着双重的作用，除了能够促进酶活和维持酶的二级、三级结构的稳定性之外[7，18]，还能够降低淀粉乳的黏度和糊化温度。房丹[17]研究了钙离子浓度对生淀粉水解的影响，结果表明，当添加160 mg/L 的钙离子时，不仅可以显著提高酶活，而且酶解过程中的黏度明显下降，葡萄糖得率提高了12 %～16 %。但是，如果钙离子浓度超过了一定的范围，反而会对酶的活性产生抑制作用[17-18]。其他金属离子对酶活力也有影响。韦荣霞等[11]在研究生淀粉糖化酶时发现，Fe2+、Mg2+、Mn2+和Co2+对该酶均有激活作用，其中Fe2+作用明显；Cu2+和K+对该酶的酶活力有抑制作用。因此，必须准确掌握各种催化因子对酶活力的影响情况，最大限度发挥酶活性能，避免引起酶水解过程的异常波动。

2.3 发酵技术

由于酒精生料发酵周期较长，且原料未经过蒸煮灭菌，发酵过程容易染菌，因此，主要选用高浓度间歇发酵技术。该技术的核心要素包括酵母菌、温度、pH 值、发酵周期。目前，酒精工业化生产主要使用的微生物是酿酒酵母，酒精生料发酵主要也是采用酿酒酵母。POET 研究表明，Fali (Fleischmann's)、Thermosac (Alltech)、Ethanol Red (LeSafre)、BioFerm AFT(North American Bioproducts)等酵母产品均能适应酒精生料发酵。国内商业化用于酒精生产的酵母产品有安琪高效酿酒活性干酵母、新疆昇力酒用高活性干酵母等。根据酵母的特点，发酵温度可以控制在26～37 ℃的范围内，或者在该范围内采用梯度控温法[19]，即在发酵初期将温度控制在33 ℃左右，高温下有利于酵母细胞代谢的快速启动。随着乙醇浓度的升高，将温度逐渐降低至20 ℃左右，降低高浓度的乙醇对酵母的伤害，延长酵母寿命。由于细菌的最适pH值为5以上，酵母为3～6，为了有效防止染菌，发酵的初始pH值可以控制在3～5[20]。通常情况下，为了同步糖化发酵更加协调，pH 值一般控制在4.5 左右。由于生料水解过程温度低，因此水解速率较低、发酵周期相对较长，在配料浓度在28%～34%的情况下，生料发酵的周期一般为72～96 h[3，5，16，21]。RASMUSSEN等[3]在研究玉米酒精生料发酵时，配料浓度为35%（w/w），按醪液量的0.25 %添加干酵母（Fermentis Ethanol Red,Lesaffre Yeast Corp.），初始pH 值为4.5，发酵温度27 ℃，在发酵96 h 后，乙醇浓度达到了147 g/L。赵二永等[14]在研究小麦酒精生料发酵时，配料浓度为30 %（w/w），按醪液量的0.025 %添加安琪高效酿酒活性干酵母，初始pH 值为4.5，发酵温度30 ℃，在发酵90 h后，乙醇浓度达到了137.8 g/L。

2.4 染菌防治技术

与传统发酵相比，酒精发酵过程中的清洁和卫生方面的管理是很不严格的，除了生产菌外，还会从原料、空气、水等带入一定数量的杂菌，杂菌感染是影响酒精得率的主要因素。常见杂菌包括乙酸菌、乳酸菌、枯草芽孢菌等，其中乳酸菌是最主要的杂菌，几乎从所有厂里分离出来的菌群中都有[20]。少量杂菌不会对发酵过程产生明显的影响，但如果杂菌大量繁殖，就会给酒精生产带来严重损失[22]。由于酒精生料发酵周期较长，且原料未经过蒸煮灭菌，因此，相比传统的酒精发酵工艺，发酵过程更容易染菌。因此，能否有效控制生料发酵过程中杂菌污染是决定该项技术能否实现推广的关键因素之一，这对于保证酒精生产的稳定性以及经济效益至关重要。

2.4.1 抗菌剂

选择合适的抗菌剂是酒精生产过程中控制杂菌最有效方法和最关键的环节。抗菌剂是抑制微生物生长的化合物，比如防腐剂，有双氧水、焦亚硫酸钾；例如抗生素，有青霉素、莫能菌素、四环素、链霉素和维吉尼亚霉素（见表1）。酒精生产中常采用的抗菌剂有漂白粉、青霉素、安菌泰、克菌灵、酒花等。

表1 乙醇工业上使用的抗菌剂

漂白粉作为消毒剂已经广泛应用在自来水中，其在自来水中产生的次氯酸和次氯酸根能够穿过细菌的细胞壁进入细菌内部，在氯离子的氧化作用下，细菌内的某些酶系受到破坏，导致细菌死亡[23]。笔者曾在拌料过程中添加有效氯含量为0.5～2.0 mg/mL的漂白粉，并维持1～2 h，对控制生料发酵的染菌水平起到了很好的效果。陈世忠等[24]在发酵醪中添加漂白粉杀菌，有效控制住了杂菌的数量，挥发酸 从0.13～0.15 mg/mL 降 到0.11 mg/mL 以 下。ClO2也是非常好的替代抗生素用于燃料乙醇生产过程中防止和控制染菌的抗菌剂。由于ClO2作为抗菌剂，其作用受玉米乙醇生产过程中的环境pH值和温度的影响很小，因此有很明显的优势。ClO2的使用可以与很多工艺过程相结合并得到很好的控制，比如对用于扩培和发酵的物料的预处理，对拌料水、回配清液和CIP 清洗液的消毒。ClO2被认为是一种潜在的替代抗生素的安全的抗菌剂，可以用于所有需要控制和防止染菌的工业发酵中[20]。

酒精工业生产主要通过添加抗生素来控制杂菌污染。由于酒精生料发酵的拌料温度和水解温度一般为50～60 ℃，非常适合乳酸菌的生长和繁殖，因此，必须在拌料过程中就添加抗生素。另外，在发酵前期的醪液、清液和糖浆贮存时，也需要添加适量的抗生素。北美主要使用青霉素G（有时青霉素V）和维吉尼亚霉素来处理燃料乙醇发酵过程中的染菌。维吉尼亚霉素推荐的添加量是0.25～2 mg/L[25]，低于2 mg/L 时，都不会对酵母乙醇发酵产生影响，但是当浓度达到20 mg/L 左右时，酵母消耗葡萄糖的速率就会降低[26]。试验结果表明，添加维吉尼亚霉素的发酵组（0.5 mg/kg 淀粉浆）比对照组的乙醇得率高11 %[27]。国内主要使用青霉素、安菌泰（商品名）、莫能菌素等来处理燃料乙醇发酵过程中的染菌。刘劲松[28]研究了生料发酵中复合抑菌剂的效果，结果表明，青霉素1.5 mg/L、莫能菌素1 mg/L、克茵灵0.5 mg/L、杆菌肽0.5 mg/L 的添加量时，抗菌控制效果最佳。孙振江等[29]研究了青霉素、安菌泰、莫能菌素3 种杀菌剂在木薯酒精发酵中的杀菌效果，指出3 种杀菌剂均能有效杀菌，最好在发酵初期添加，但杀菌剂添加量不能超过10 mg/L，否则会对酵母产生抑制作用。

另外，从酒花中提取得的酒花天然抗菌剂Iso tab 产品也已经在欧美的酒精企业中广泛应用[30]，是未来替代抗生素的发展方向之一。酒花中含有的多种有机酸，对酒精发酵过程中的杂菌都具有良好的抗性，可以消除跨膜pH 值梯度，抑制细菌的生长[31-32]。WONGSAGONSUP 等[5]在生料发酵前，在醪液中添加2 mg/L 的维吉尼亚霉素和40 mg/L 的酒花提取物。

2.4.2 醪液pH值调控

由于当pH 值低于5.0 时，可以大大降低以乳酸菌为代表的细菌的生长速率，因此，大多数乙醇生产厂都会通过添加硫酸来调节醪液pH 值至4.5 以下，实现对细菌感染的控制。有些工厂采用连续发酵工艺，甚至将发酵初始的pH 值调整至4.0 或者更低[20]。然而，较低的pH 值也会降低酵母的代谢活力和糖化酶的活力[33-34]，并导致乙醇得率的下降。如果物料中存在弱酸，如乳酸、乙酸，调低pH值会导致弱酸的非解离态浓度升高，进而增强了弱酸对酵母生长和乙醇发酵的抑制作用[20]。

2.4.3 清洁生产措施

酒精生产设备主要以各种罐体和管道为主，制浆水罐、拌料罐、水解罐、发酵罐、糖浆贮罐等各种罐体和管道的材质以不锈钢为主，防止菌体的藏匿和滋生，定期用双氧水、酸碱液等消毒试剂清洗罐体和管道是清洁生产的主要措施[20]。另外，还可以定期对环境进行消毒，尤其是制浆水罐。制浆水罐是常被忽视，进水和贮水周期等问题在大多数工厂都没有严格的管理。由于制浆水中存在有机物和细菌，因此在贮存过程中微生物会滋生并产生有机酸。制浆水罐有两个缺陷，一是设计时没有带搅拌，二是温度低于60 ℃（而不是高于71.1 ℃），使得产乳酸细菌和其他耐高温的细菌可以存活和生长。由于缺失搅拌，时间一长，底部就会产生沉淀，这些沉淀物可以为杂菌提供保护，甚至在温度较高的液体中也有保护作用。防止染菌的主要措施是改进对制浆水罐的日常监测，通过实验室测试，掌控潜在的风险。解决此处问题的方法是停机后清除罐内的沉积物，定期添加商业化杀菌剂可以控制细菌数量。当然，如果此处的问题反复出现，那么可以通过重新设计装置来实现将温度加热至71.1 ℃左右，达到巴斯消毒法的效果[20]。

2.4.4 其他方案

玉米在采收和储存过程中都会携带各种微生物，尤其是当玉米籽粒出现破损、环境条件适宜的情况下，微生物还会滋生并产生有毒有害物质。对此，有人研究通过化学法、辐射法、物理筛分法等途径对储存过程中和加工前的玉米进行预处理，杀灭微生物、消除有毒有害成分[35]。但是，这种针对玉米籽粒的前处理方式，或者因为处理成本高，或者因为装备设施无法实现规模化应用，都尚不具备工业化推广应用的条件。

2.5 蒸馏及DDGS颜色控制

由于淀粉生料发酵结束时，残淀粉含量较高，蒸馏过程中可能会出现残淀粉糊化，黏度增加，导致蒸馏塔中残留物增加；另外，物料颗粒度细，固液分离时，清液中固形物含量高，蒸发浓缩处理量大；最终还可能导致饲料颜色加深，影响DDGS 的品质。这些问题对酒精生料发酵技术能否推广应用同样起着决定性的作用，一方面关系到能否稳定生产，另一方面也会影响饲料的销售收益。目前，有关这方面的技术研究报道还很少，需要在实际生产和试验中去摸索和解决。

3 结语

虽然酒精生料发酵技术的优势非常明显，但是，由于核心关键技术（酶制剂）的脱节以及系统性应用方案的配套不足，导致该项技术未能在世界范围内推广。相反，掌握了核心关键技术的美国POET公司旗下的27家燃料乙醇企业已经全面应用生料发酵技术，并且为企业带来了十分显著的效益。因此，我们必须勇于创新，迎难而上，系统性地攻克阻碍技术发展的各个障碍，尤其是要集中各方面的科研力量，开发适合我国生产特色的酶制剂产品，最终实现该项技术的全面推广应用，推动我国生物燃料乙醇事业的发展。

当前，全球生物燃料乙醇产业蓬勃发展，以美国和巴西为代表的世界最大的生物燃料乙醇生产国凭借其国内廉价的原料和先进的生产管理技术生产出低价的产品，不断威胁着国内生物燃料乙醇生产企业。创新将成为国内企业面对挑战和机遇并存的新时期的唯一制胜法宝。