三种常见杀菌剂对白僵菌纯化以及生产中作用研究

王雪+马军+兰莹+赵东鹏+张跃华+赵晨晨

摘 要：为筛选出适合白僵菌生产中使用的高效杀菌剂。以3种常见的杀菌剂作为试剂，采用抑菌圈法和生长速率法，研究3种杀菌剂对白僵菌生产中常见杂菌的抑制效果及其对白僵菌菌丝生长的影响。结果表明：在最高稀释浓度条件下，脱氢乙酸钠抑制3种杂菌效果最好的同时，对白僵菌的抑制率也为最大。二氯异氰尿酸钠对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制效果优于富马酸二甲酯，但对枯草芽胞杆菌的抑制效果较差，且对白僵菌影响较小，可作为白僵菌杀菌剂。

关键词：白僵菌；杀菌剂；杂菌；抑制试验

中图分类号：S482.2 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170532001

白僵菌属虫草菌科（Cordycip-itaceae），虫草属（Cordyceps）[1]，是一类重要的昆虫致病真菌，被广泛应用于农林害虫防治[2]。其菌落初期多呈现为白色，而后变为淡黄色或淡红色，背面无色、淡黄至粉红色[3]。在分生孢子梗或菌丝上聚合成在低倍镜下即可看到的球形、卵形的孢子头[4]。在白僵菌生物农药与传统化学农药相比中，白僵菌生物农药具有不产生抗性、专一性强无化学农药残留、和使用安全等无可比拟的优势[5]。但因生产由于大量细菌及放线菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 金葡菌）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）等与白僵菌的生长条件相近，常导致白僵菌生产过程中严重污染，影响生产效率。在白僵菌生产过程中，需要即能有效分离又不抑制白僵菌生长的分离培养基，并能保证分离和培养过程中白僵菌的生长不受非目标菌的影响。该研究通过抑菌圈与生长速率法，测试了3种常见杀菌剂对白僵菌生产中常见杂菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果，同时结合3种杀菌剂对白僵菌菌丝的影响结果，筛选出抑制效果较好的药物，以期为解决白僵菌生产中的实际问题提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试药剂

脱氢乙酸钠（DHA-S）、富马酸二甲酯（DMF）、二氯异氰尿酸钠（SDIC）。

1.1.2 供试菌株

卵孢白僵菌（盐城市神微生物菌种科技有限公司提供）。

1.1.3 供试试剂

依据药剂推荐的最佳浓度范围進行不同浓度梯度的设置，调整至3种药剂的稀释倍数相同。DHA-S、DMF、SDIC配比稀释浓度均分别为0.2mg/mL、0.4 mg/mL、

0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL。

1.1.4 培养基的配方

PDA培养基琼脂20.0g/L、马铃薯200g/L、葡萄糖20.0g/L；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化钠10.0 g/L。

1.2 实验方法

1.2.1 制备卵孢白僵菌悬液

称取0.5g卵孢白僵菌粉剂，在无菌工作条件下，放入装有100mL无菌水的锥形瓶中，封口并震荡3～5min，使其均匀分散，制成菌悬液。

1.2.2 白僵菌的分离与纯化

无菌移液管移取0.1mL制好的白僵菌菌悬液，取无菌三角玻棒，把上述菌悬液在PDA平板表面涂抹均匀。将制备的带菌平板倒置于28℃恒温箱中培养2d。无菌条件下取培养的菌株，用接种环挑取少量菌丝于PDA培养皿，于28℃培养箱内静置培养2d。在无菌工作条件下，接种于PDA试管斜面培养基，置于28℃培养箱内静置培养2d。后置于4℃冰箱内保存备用。

1.2.3 抑菌圈法测3种杀菌剂对白僵菌有害杂菌的抑制效果

取4℃冰箱保存的3种斜面杂菌菌株，在无菌条件下，分别加入20mL无菌水，充分振摇稀释后分别置于已灭菌的50mL三角瓶内，得到3种菌悬液，涂布培养，用灭菌镊子夹取直径为6mm消毒滤纸片投入不同药液中浸药3min，对照组将滤纸片放于无菌水中浸泡3min，每组3次重复；然后将带不同浓度药的滤纸片分别放置牛肉膏蛋白胨培养皿中央，并做好标记。置于28℃恒温培养箱内培养，24h后采用十字划线法测量抑制圈直径并记录。

1.2.4 生长速率法测3种杀菌剂对白僵菌的抑制效果

取4℃冰箱保存的斜面白僵菌菌株，在无菌工作条件下，转接到含有不同浓度梯度的3种杀菌剂的固体培养基上。以不含药剂的PDA培养皿作为对照，每组3次重复；观察菌丝生长情况，采用十字交叉法进行各组菌丝直径的确定。按以下公式计算菌丝生长抑制率[6]：

（1）

2 结果分析

2.1 3种杀菌剂对白僵菌有害杂菌大肠杆菌的抑制效果

对白僵菌有害杂菌大肠杆菌的抑制试验结果表明：对大肠杆菌抑制效果最佳的为DHA-S，在其测试浓度范围内，6组处理浓度的效果都很明显，抑菌圈直径范围在21.7～42.0mm内；SDIC的效果次之，抑菌圈直径变化范围为13.1～34.2mm；而DMF效果最低，抑菌圈直径在7.57～ 17.8mm范围内。且不同浓度药品间差异较大（见图1）。

2.2 3种杀菌剂对白僵菌有害杂菌金黄色葡萄球菌的抑制效果

对金黄色葡萄球菌的抑制试验结果表明：DHA-S对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直径范围为27.2～41.6mm；DMF抑菌圈直径最小为17.0 mm，1.0 mg/mL浓度的抑菌圈直径为29.9mm，而在1.2mg/mL浓度的抑菌圈直径为24.5mm，抑制效果与1.0mg/mL浓度液比抑制效果较差；而SDIC对金黄色葡萄球菌的抑制效果较差，抑菌圈直径范围在8.5～22.7mm内。每种杀菌剂6组处理浓度的抑菌圈直径形成较大差异（见图2）。

2.3 3种杀菌剂对白僵菌有害杂菌枯草芽孢杆菌的抑制效果

对枯草芽孢杆菌的抑制试验结果表明：3种杀菌剂的6组处理浓度的效果都很明显，其中对枯草芽孢杆菌抑制效果最佳的为DHA-S，其抑菌圈直径范围为21.7～ 42.5mm；SDIC效果次之，抑菌圈直径范围在7.9～20.3mm，且0.6mg/ml浓度与0.8mg/mL浓度形成较大差异；而DMF效果最低，抑菌圈直径范围为7.6～16.2mm（见图3）。

2.4 3种杀菌剂对白僵菌菌丝生长的抑制效果

对白僵菌菌丝生长的影响试验结果表明：3种杀菌剂对白僵菌菌丝生长有明显的抑制，就其抑制效果而言，在1.2mg/ml浓度条件下，DHA-S对白僵菌菌丝生长的抑制效果最强，高到100%，DMF对白僵菌菌丝生长的抑制效果最弱为53.56%，SDIC可达到62.45%（见图4）。

图4 对白僵菌菌丝的生长抑制率

3 结论分析

实验结果表明：DHA-S抑制效果最好，但DHA-S对白僵菌菌落的生长有较大的影响，不符合在生产中即能抑制杂菌生长又对白僵菌菌丝生长无抑制效果或抑制效果较弱的要求。SDIC和DMF对有害杂菌有一定的抑制作用，且不会对白僵菌生长产生不良影响，都可以作为白僵菌生产中的抑菌剂。同时SDIC和DMF对杂菌的抑制效果不同，因此可以根据生产中杂菌污染情况选择性地使用符合要求的药剂。

参考文献

[1]吕思行，刘吉平，汤历，等.两广地区家蚕白僵菌的SSRs遗傳多样性[J]. 昆虫学报， 2012，55（10）.

[2]Feng MG. Production， formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control： current status[J]. Biocontrol Science & Technology， 1994， 4（1）：3-34.

[3]许寿涛.杀蚜球孢白僵菌孢子乳悬剂的改进、中试及田间应用效果评价[D]. 浙江大学， 2002.

[4]赫英伟.白僵菌的研究概况[J].黑龙江农业科学， 2010（4）：

145-147.

[5]张英财，农向群，张泽华，等. 18种化学农药与绿僵菌相容性研究[J].中国生物防治学报.2012，28（2）.

[6]杨华，徐金柱，秦长生，等.3种真菌抗生素对绿僵菌和6种非目标真菌的生长影响分析[J].广东林业科技， 2014，30（6）：34-39.