响应面分析法优化一株窖泥源酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）RL1菌株产丁酸发酵培养基

彭志云，赵 东，胡晓龙，何培新，张 勇，郑 燕，牛广杰

（1.宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007；2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450001；3.河南省百泉春酒业有限公司，河南新乡 453000）

丁酸（Butyric Acid）是一种重要的四碳短链有机酸，广泛地应用于化工、食品和制药等行业。丁酸及其衍生物有多种用途，比如，丁酸可作为生产塑料和纤维制品的添加剂以增加其柔韧性、疏水性和耐光性[1]，也可以通过生物转化为丁醇来缓解石油能源枯竭和日益增长的需求压力，是一种具有巨大潜力的能源物质；丁酸酯可作为饮料、食品以及化妆品中的果味香料[2]；丁酸在胰岛素抵抗以及血红蛋白病和直肠癌的治疗等方面的应用具有很大潜力[3-5]。厌氧条件下，丁酸可以由不同种属细菌菌株产生，而梭菌属由于具有较高的丁酸产率和产量被选作丁酸生产的优势种属，目前用于工业化研究的梭菌属细菌主要有C.tyrobutyricum[6-12]、C.butyricum[13-15]和C.thermobutyricum[16]，而C.tyrobutyricum因能够产生高浓度丁酸且具有高酸耐受性、高选择性等优势，成为丁酸工业化发酵生产研究的最佳菌株。

响应面法(response surface methodology,RSM)是一种开发、改进和优化多个变量对目标物响应变化的有力工具，它将统计学与数学相结合，通过建立和分析回归方程来量化目标产物特性与过程变量之间的函数关系[17]。与单因素试验和正交试验相比，RSM 不仅能够研究变量之间的交互作用，而且因为试验次数少、周期短、回归方程精确度高等优势广泛地应用于生物、化工、食品、农业等领域。

培养基是微生物生长和发酵的基础，培养基中的成分和浓度对丁酸的生产具有很大影响，本研究采用响应面法来优化C.tyrobutyricumRL1 发酵培养基来提高丁酸的产量，首先通过Plackett-Burman设计对培养基中的9 个主要因素进行筛选，找出影响丁酸产量的显著因素，再利用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，最后通过Box-Behnken 设计及响应值分析来确定显著影响因素的最佳浓度，从而获得C.tyrobutyricumRL1的最佳发酵培养基。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 供试菌株

C.tyrobutyricumRL1，本实验室前期从窖泥中分离保存。

1.1.2 主要试剂

丁酸、2-乙基丁酸（色谱纯），购自日本TCI 公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.1.3 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS），上海申安医疗器械厂；超净工作台（SW-CJ-ID 型），苏州净化设备有限公司；厌氧产气袋（C-11）、培养袋（C-41），日本三菱；智能生化培养箱（SHP-250），上海鸿都电子科技有限公司；电子天平（ME204E），梅特勒-托利多仪器有限公司；离心机TGL-16G，上海安亭科学仪器厂；气相色谱仪（7820A）和HP-INNOWAX 毛细管色谱柱（30 m×0.255 mm×0.25 μm），美国安捷伦公司。

1.1.4 培养基的制备

种子活化培养基：即增强梭菌培养基（RCM 培养基），参照Hu[18]文献中报道的方法配制。

基础培养基（g/L）：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨5，氯化钠5，乙酸钠3，磷酸氢二钾2.5，七水合硫酸镁0.6，硫酸铵3，七水合硫酸亚铁0.03，硫代乙醇酸钠0.5，碳酸钙5，pH6.8，121 ℃灭菌20 min，培养基中葡萄糖和碳酸钙均与其他组分分开灭菌，于接种前加入。

1.2 试验方法

1.2.1 RL1菌株种子的活化和培养方法

取-20 ℃甘油保藏的菌悬液300 μL 接种于装有10 mL 种子活化培养基的试管中，于添加除氧剂的厌氧袋中34 ℃厌氧活化培养24 h，作为一级种子。将一级种子以3 %（v/v）的接种量转接至工作体积为100 mL 且装液量同为100 mL 的厌氧瓶中（在RL1 产气后接入无菌输液管用于排气），34 ℃恒温培养12 h，作为二级种子。将活化好的二级种子以3 %（v/v）的接种量转接至上述同样条件的厌氧瓶中，34 ℃恒温静置培养72 h。

1.2.2 发酵液前处理

取培养72 h 的发酵液15 mL，10000 r/min 离心10 min 去除菌丝体及碳酸钙，取10 mL 稀释适当倍数的上清液，加25 μL 72 %硫酸进行酸解，使上清液中的有机酸游离出来，加入40 μL 2-乙基丁酸作为内标充分混匀，乙醚萃取，再用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤即得待测液。

1.2.3 发酵液中丁酸浓度的定量分析

发酵液中丁酸浓度的检测采用气相色谱（GC）和内标法进行定量分析。

1.2.3.1 标准曲线的绘制

用RCM 培养基准确配制50 mg/mL 的丁酸母液，并依次稀释配成8 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 的标准溶液（每个浓度平行3次）。每个浓度梯度的标准溶液取10 mL，加入40 μL 2-乙基丁酸（内标）充分混匀，乙醚萃取，经孔径为0.22 μm 微孔滤膜过滤，上样。以标准品浓度为纵坐标，丁酸与内标的峰面积比为横坐标，绘制标准工作曲线。

1.2.3.2 色谱条件

采用安捷伦7820A 气相色谱仪进行丁酸浓度检测。色谱条件参照陈兴杰等的报道[19]并稍作修改：进样口温度200 ℃，柱箱起始温度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 的升温速率升温至220 ℃，保持2 min。检测器温度250 ℃；气体流量：氢气35 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气20 mL/min；进样方式：分流进样，分流比为20∶1；进样体积：1 μL。

1.2.4 培养基优化试验设计

1.2.4.1 Plackett-Burman设计

利用Plackett-Burman 设计考察基础培养基中的9 个成分对RL1 产丁酸的影响。通过Design-Expert.8.05b 软件对试验进行设计，选取试验次数N=12 的设计方案，考察因素及编码值分别为葡萄糖(X1)、酵母粉(X2)、蛋白胨(X3)、乙酸钠(X4)、氯化钠(X5)、七水合硫酸镁(X6)、硫酸铵(X7)、七水合硫酸亚铁(X8)和碳酸钙(X9)，每个因素选取高低两个水平，分别用+1和-1表示。具体试验设计方案见表1。

1.2.4.2 最陡爬坡试验

响应面拟合方程需要建立在最佳值区域附近才能充分反映真实情形。最陡爬坡试验是一种能够快速有效地接近最佳响应区域的试验方法，它以Plackett-Burman 实验拟合模型为基础，根据显著因素效应的正负及大小来设定爬坡方向及变化步长，而其他非显著因素既可根据效应的正负和大小设定（例如表现为正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值），也可从经济角度出发选取较低值。

1.2.4.3 Box-Behnken设计

响应面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是一种解决多变量问题的常用统计方法，它通过合理的试验设计得出相应的数据并建立多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系从而确定最佳工艺参数。

根据Plackett-Burman 试验和最陡爬坡试验找出试验的显著因素与水平，采用Box-Benhnken 设计对发酵培养基组分进行响应面分析试验。每个因素取低中高3 个水平，编码为(-1，0，1)，试验的设计及结果分析均采用软件Design-Expert.8.05b。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

将配制好的不同浓度的丁酸标准溶液按照上述方法处理并进行气相色谱检测，每个浓度做3 个平行样品。取丁酸和2-乙基丁酸峰面积比的平均值，以丁酸浓度（g/L）为纵坐标，丁酸与2-乙基丁酸的峰面积之比(A/A)为横坐标作图（图1），得到丁酸的标准曲线回归方程为y=5.9716x+0.4495（R2=0.9987,n=5）。

图1 丁酸标准曲线

2.2 Plackett-Burman试验筛选显著影响因素

把发酵液中的丁酸浓度（g/L）作为因变量，采用Plackett-Burman 试验研究培养基中各组分对RL1 产丁酸的影响，筛选出对丁酸生成影响显著的因素。试验设计及结果见表1。利用Design-Expert 8.05b 软件对表1 结果进行统计分析，Plaekett-Burman 试验中各因素水平的浓度以及显著性分析结果如表2 所示。由表中信息可知，整体模型显著，且在α=0.05 的显著水平上，对丁酸生成影响显著的3 个因素分别是葡萄糖(X1)、碳酸钙(X9)、蛋白胨(X3)。选取这3个因素进行下一步操作试验。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果

表2 Plackett-Burman试验结果分析

2.3 最陡爬坡实验设计及结果

对Plackett-Burman 的试验结果分析找出对丁酸生成影响不显著的因素，其中起正效应作用的酵母粉、乙酸钠和氯化钠取高水平值，起负效应的七水合硫酸镁、硫酸铵和七水合硫酸亚铁取低水平值。对丁酸生成具有显著正效应作用的葡萄糖、碳酸钙和蛋白胨的变化方向以及步长的设计及结果见表3。

2.4 Box-Behnken设计筛选显著因素的最佳浓度

2.4.1 Box-Benhnken试验设计及方差分析

通过Plackett-Burman 试验确定对丁酸生成影响显著的因素，再由最陡爬坡试验确定其接近响应值区时的浓度，最后采用Box-Benhnken 试验设计进行响应面分析，显著因素的水平见表4，Box-Behnken试验设计表及结果见表5。

表3 最陡爬坡试验设计及结果 (g/L)

表4 响应面因素设计水平表

以发酵液中丁酸浓度为响应值，利用Design-Expert.8.05b 软件对表5 中的试验结果进行二次回归分析，得到的回归分析模型方程为：

表5 Box-Behnken试验设计表及结果

该模型可信度分析结果及模型回归方程的方差分析分别见表6和表7。

表6 模型可信度分析

表7 回归方程的方差分析表

模型可信度分析见表6，其中决定系数R2=0.9921，表明该模型可以解释99.21 %试验中响应值的变化，方程拟合度较高。变异系数可以衡量试验中各观测值变异程度的大小，其值越低，试验的可靠性越高。本试验中CV=1.27%，数值较低，说明试验操作的准确度较高，操作可信。信噪比是判断模型是否能够提供充足信息以进行数据分析的一个重要参数，当信噪比大于4 时，可以认为模型能提供足够的信号，本试验中信噪比为24.021，符合分析所需要求。综上表明，该模型可信度较高，可以用来分析和预测RL1的最佳培养基成分。

由表7 可知，该多元二次回归方程模型的显著性检验P=0.0001，远远低于0.05，表明该模型具有良好的统计学意义。自变量X1、X2及二次项X1X2、X2X3、X12、X22、X32相关系数的P＜0.05，表明这些因素以及因素之间的交互作用会显著影响发酵液中丁酸的生成。失拟项代表试验数据与模型的拟合程度，本试验P=0.5439＞0.05，失拟不显著，因此该回归方程可以代替真实数据对试验结果进行分析。

2.4.2 响应面与等高线

保持3 个因素中任一因素处于中间值不变，可以分析剩余两个因素之间的相互作用。利用Design-Expert.8.05b 软件绘制响应面分析图及等高线，葡萄糖与蛋白胨、葡萄糖与碳酸钙以及蛋白胨与碳酸钙之间的交互作用对响应值的影响分别见图2、图3、图4。

葡萄糖是RL1 发酵产丁酸的物质基础。由图2、图3 可知，在一定范围内，发酵液中的丁酸浓度随着葡萄糖浓度的增加不断升高，当葡萄糖浓度大于85.29 g/L时，丁酸浓度不再升高且随着葡萄糖浓度的增加逐渐降低，丁酸的合成受到抑制。其原因可能是，RL1 主要利用葡萄糖发酵生产丁酸，葡萄糖浓度越高，对丁酸的生成越有利，但随着发酵过程中丁酸浓度的不断增加，培养基中的pH 值一直降低，当pH 值降低到某个特定值时，菌体的生长以及代谢产物的生成开始受到抑制，而且这种抑制作用随着发酵的进行不断增强。此外，葡萄糖的过度代谢也会加速其他酸性副产物（如乙酸等）的积累，导致pH值迅速降低。

图2 葡萄糖和蛋白胨对丁酸生产影响的响应面图及等高线图

图3 葡萄糖和碳酸钙对丁酸生产影响的响应面图及等高线图

图4 蛋白胨和碳酸钙对丁酸生产影响的响应面图及等高线图

氮源是构成生物体蛋白质、核酸及其他含氮化合物的基础，在微生物生长代谢过程中起着至关重要的作用。蛋白胨含有丰富的氮源、氨基酸等，是微生物发酵常用且重要的氮源物质，但是过量的蛋白胨也会抑制丁酸的生成，由图2和图4可知，当蛋白胨浓度大于9.37 g/L时，随着蛋白胨浓度的增加，丁酸浓度逐渐降低。

微生物生长过程中pH 值对菌株生长和代谢有至关重要的作用。随着RL1 利用葡萄糖发酵产酸的进行，培养基中的pH 值开始逐渐降低，菌体生长越旺盛，产酸越多，pH 值降低得越快，因此在培养基中添加一定量的碳酸钙，不仅可以给微生物提供微量钙元素还可以对发酵过程中的pH 值的变化起缓冲作用，避免发酵液pH 值剧烈降低。由图3、图4 可知，当碳酸钙的添加量低于11.6 g/L 时，随着其添加量的增加，丁酸浓度逐渐增加，当达到11.6 g/L后，丁酸浓度不再上升，并开始降低，表明此时的碳酸钙已经接近最大缓冲能力，增加碳酸钙的添加量不仅不能缓解pH 值的降低，微溶于发酵液中过量的钙离子也开始对丁酸的生成形成抑制作用。

综合以上分析，当培养基中葡萄糖、蛋白胨、碳酸钙的添加量分别为85.29 g/L、9.37 g/L 和11.6 g/L时，丁酸浓度达最大值。应用软件深入分析，预测在这种情况下发酵液中丁酸的最大浓度为23.09 g/L。为检验模型可靠性，分别在优化前和优化后的培养基上进行重复试验，得到基础培养基上RL1 所产丁酸浓度为14.23 g/L，而最佳培养基上的丁酸浓度为22.96 g/L。试验验证结果与预测值接近，说明该模型可以真实地反映培养基中的主要组分对丁酸生成量的影响，且优化后较优化前丁酸浓度提高了61.35%。

3 结论

采用响应面分析法对RL1 产丁酸培养基进行优化。首先采用Plackett-Burman 设计对培养基中的葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、乙酸钠、氯化钠、七水合硫酸镁、硫酸铵、七水合硫酸亚铁、碳酸钙9 个因素进行筛选，确定出葡萄糖、碳酸钙和蛋白胨是影响丁酸生成的显著因素。改变3 种显著因素的浓度，利用最陡爬坡路径逼近最大产酸响应区域，通过Box-Behnken 设计及其响应值分析确定出最佳发酵培养基成分为(g/L)：葡萄糖85.29，酵母粉7.5，蛋白胨9.37，氯化钠7.5，乙酸钠4.5，磷酸氢二钾2.5，硫酸镁0.3，硫酸铵1.5，硫酸亚铁0.015，硫代乙醇酸钠0.5，碳酸钙11.6，此时丁酸浓度最大预测值为23.09 g/L。对模型准确性进行试验验证，得到的实际浓度为22.96 g/L，培养基优化后的丁酸浓度较优化前的14.23 g/L提高了61.35%，优化效果显著。