不同酿造条件对黄酒中精氨酸代谢的影响研究

杨晓婷，陆筑凤，赵可及，李娟娟，李加友

（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbomate，EC）是酿造酒中可能会出现的一种2A 级致癌物，酒中氨基甲酸乙酯的形成受不同原料和酿造工艺的影响。黄酒中含有丰富的精氨酸，精氨酸可降解产生尿素、瓜氨酸或氨甲酰磷酸，而这些物质都能与乙醇作用形成氨基甲酸乙酯[1]。因此，控制黄酒中精氨酸的代谢有利于降低成品酒中氨基甲酸乙酯的含量。

酒中精氨酸的代谢绝大部分源于酵母降解精氨酸的尿素循环途径（urea cycle pathway）和乳酸菌的精氨酸脱亚胺途径（arginine deiminase pathway，简称ADI 途径）。发酵起始阶段酵母快速利用精氨酸产生尿素，酵母细胞会将过高浓度的尿素排出胞外[2]。采用基因敲除方法构建精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，该酵母酿造清酒过程中未发现尿素的累积现象[3]。将脲基酰胺酶基因DUR1,2 克隆到TPI 强启动子和终止子之间的位点，再通过同源重组方式将受强启动子调控的目的基因整合到黄酒酵母的基因组中，获得低产尿素的黄酒酵母85#DUR1,2，其产尿素量比出发菌株降低了69.9%[4]。利用改造过的不同菌株生产黄酒，EC 含量降低正比于尿素的下降量[5]。通过在黄酒发酵过程中添加低浓度抑制剂L-鸟氨酸盐酸盐，有利于瓜氨酸积累，从而激发OTC 酶表达，酶解瓜氨酸速度加快直接导致EC 生成量降低[6]。在黄酒酿造后期添加硫酸铵作为补充氮源，能在一定水平上降低氨基甲酸乙酯的浓度[7]。从浓香型白酒酒醅中分离到具有高精氨酸利用能力和高瓜氨酸积累特性的乳酸菌类菌株，通过基因型和表现型验证以及模拟窖内发酵均证实它们可以促进瓜氨酸积累[8]。

在不影响产品品质的前提下，本文拟利用工艺控制方法限制发酵过程中精氨酸的代谢，从而减少尿素、瓜氨酸等氨基甲酸乙酯前体物的形成。

1 材料与方法

1.1 材料

原辅料：糯米，市售；红曲米，古田县帝源红曲厂；麦曲，江苏微康生物科技有限公司；酒曲和黄酒酵母，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌粉，北京川秀国际贸易有限公司。

耗材及试剂：精氨酸、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、D5-氨基甲酸乙酯均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙醚均为色谱纯；硼酸、碳酸氢钠、无水乙酸钠、正己烷均为分析纯。碱性硅藻土固相萃取柱，填料4000 mg，柱容量12 mL。

1.2 主要仪器和设备

戴安U3000 高效液相色谱仪（美国戴安公司），气相色谱-质谱仪（美国热电公司）。

1.3 黄酒的酿造

500 g糯米浸泡48 h，蒸饭前沥干，上汽蒸25 min。用摊饭法冷却米饭温度至28 ℃时，将其加入发酵缸中，然后加入25 g 麦曲、5 g 黄酒酵母（加入前按照使用说明进行活化）、1000 mL 温开水（温度40 ℃），搅拌均匀，使得发酵剂均匀分布。将发酵缸置于25 ℃培养箱，5 d 后将培养温度调整为18 ℃，并用柠檬酸调节体系的pH值为3.5。发酵过程中每隔14 d 定期取样检测醪液中的精氨酸含量；并且检测了第56 天醪液中的EC 含量。实验中，只将上述操作中需要考察的参数按照方案进行调整，而其他参数保持不变。以上工艺均按照无菌操作要求，严格控制环境中杂菌进入发酵体系。

1.4 精氨酸含量的测定

准确移取0.5 mL 酒样、0.5 mol/L NaHCO3溶液0.5 mL 和25 mL/L DNFB 衍生化试剂0.2 mL 置于10 mL试管中，混合后置于60 ℃水浴中避光恒温加热60 min，避光冷却至室温后用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液定量至5 mL，静置15 min，过0.22 µm 膜后可进样分析。

采用戴安U-3000高效液相色谱仪，其中色谱柱为Acclaim120，C18，5 μm Analytical（4.6×250 mm），紫外检测波长360 nm，进样量为20µL，柱温30 ℃，流动相B 为超纯水，流动相C 为乙腈溶液，流动相D为乙酸钠，流速0.8 mL/min，时间26 min。梯度洗脱程序见表1。

表1 高效液相色谱的洗脱条件

1.5 氨基甲酸乙酯含量的测定

取2 g经5 min超声脱气后的黄酒，加入100µL的2.00µg/mL D5-氨基甲酸乙酯使用液，加入0.3 g氯化钠，超声溶解，混匀后，在真空条件下加入碱性硅藻土固相萃取柱，静置10 min。先用10 mL 正己烷淋洗，再用10 mL 的5 %乙酸乙酯-乙醚溶液以1 mL/min 的流速进行洗脱，用装有2 g 无水硫酸钠的玻璃漏斗对洗脱液进行脱水，室温下氮吹至0.5 mL，用甲醇定容至1.00 mL 制成定液。气相色谱-质谱仪分析参考条件见表2。

表2 气相色谱-质谱仪分析参考条件

2 结果与分析

2.1 乳酸菌对黄酒中精氨酸含量的影响（表3）

表3 乳酸菌含量对黄酒中精氨酸代谢的影响

传统黄酒酿造属于开放式操作，环境微生物种类和数量是影响产品品质的重要因素[9-10]，其中来源于环境中的乳酸菌是影响黄酒酿造的重要微生物之一。乳酸菌可以通过ADI 代谢途径分解精氨酸产生瓜氨酸和氨甲酰磷酸，这两种代谢产物均为形成EC 的前体物质。通过比较发酵体系中乳酸菌的不同含量对醪液中精氨酸含量的过程变化和产品中EC 含量的影响，考察黄酒酿造过程中乳酸菌对精氨酸代谢和EC 形成的作用。结果表明，乳酸菌含量越高，醪液中检测到的精氨酸浓度就越低，产品中EC 含量越高。未添加乳酸菌处理的精氨酸含量为33.87 mg/L，添加0.1 g 乳酸菌的醪液中精氨酸含量仅为10.43 mg/L，下降了69%；而氨基甲酸乙酯的含量却从0.226 mg/L 上升到0.264 mg/L，增加了17 %。在黄酒酿造中，乳酸菌有明显的精氨酸代谢能力，随着乳酸菌含量的增加，精氨酸代谢速度变快，精氨酸的转化率也更高，产生了更多的氨基甲酸乙酯前体物质，因此形成了更多的氨基甲酸乙酯。

2.2 酵母菌对黄酒中精氨酸代谢的影响（表4）

酵母菌中的精氨酸水解酶可以将精氨酸转化为尿素，也是形成EC 的重要前体物质。选取3 种不同酵母菌，分别为黄酒专用安琪酿酒高活性干酵母（简称黄酒酵母）、酿酒酵母ZJXU、酿酒酵母ZJXU1508，比较不同酵母菌对精氨酸代谢的影响。结果表明，3 种酵母中以黄酒酵母的精氨酸代谢能力最强，醪液中的氨基甲酸乙酯含量也较另外两个菌株的处理更高。酿酒酵母ZJXU 是我们筛选所得，酿酒酵母ZJXU1805 是在酿酒酵母ZJXU的基础上经过进一步选育出来的生产菌株，醪液中的精氨酸含量较出发菌株增加31 %，氨基甲酸乙酯含量下降15%，酿酒酵母ZJXU1805 能明显降低氨基甲酸乙酯的形成。方逸群等[11]曾对酿酒酵母进行过选育，也获得了低产氨基甲酸乙酯工程菌株，菌株选育是控制产品中氨基甲酸乙酯含量的一种有效手段。

表4 酵母对黄酒中精氨酸代谢的影响

2.3 红曲米对黄酒中精氨酸代谢的影响（表5）

表5 红曲米对黄酒中精氨酸代谢的影响

在浙江、福建等地酿造黄酒时有添加红曲的习惯，一方面红曲米可以改善酒液的颜色，另一方面，红曲也可以产生酒精，是一种酿酒微生物[12]。在黄酒酿造过程中添加部分红曲，比较醪液中精氨酸的代谢情况，发现精氨酸的含量随着红曲米添加量的增大而显著增加；28 d以后，添加了红曲米的醪液中精氨酸含量有所下降。随着红曲米用量的增加，氨基甲酸乙酯含量也显著增加，红曲米用量为2.00 g时，醪液中的精氨酸含量最高，达到57.11 mg/L，较不添加红曲米的对照组提高了86 %，醪液中的氨基甲酸乙酯也增加了61%。红曲米中的红曲菌能产生精氨酸，并分泌到醪液中，而精氨酸的进一步水解产生了氨基甲酸乙酯的前体物质[13]，促进了氨基甲酸乙酯的形成。

2.4 醪液pH值对黄酒中精氨酸代谢的影响（表6）

表6 醪液pH值对黄酒中精氨酸代谢的影响

传统黄酒酿造过程采用开放式操作，环境微生物进入醪液后会改变产品品质，通常会添加酸浆水[14]降低醪液pH 值达到控制杂菌生长的效果，因此有“三浆四水”的工艺。但是，黄酒酿造中发挥作用的微生物种类较多，不同pH 值条件下微生物的代谢不同，也会对酒的品质产生重要影响[15]。根据传统黄酒酿造中醪液pH 值，比较不同pH 值对黄酒酿造中微生物代谢精氨酸的影响。结果表明（表6），不同处理中精氨酸含量随着酿造时间延长而有所上升，特别是在相对较高pH 值时，精氨酸含量会成倍增加，28 d 时检测到pH4.5 的醪液中精氨酸含量是pH2.5 时的醪液的4.9 倍；但是从28 d 开始精氨酸含量保持相对稳定，没有明显变化。而pH4.5时的醪液中氨基甲酸乙酯含量却仅为pH2.5 的醪液的74%。当醪液的pH 值相对较低时，体系中精氨酸的含量较少，随着醪液pH 值的上升，精氨酸含量呈上升趋势，而氨基甲酸乙酯的含量呈下降趋势。可能是在较低pH 值时促进了精氨酸的分解，因此醪液中检测到的精氨酸含量较低，而氨基甲酸乙酯的含量却明显增加。

3 结论

通过对乳酸菌、醪液pH 值、酵母菌和红曲菌的单因素比较，初步确定了以上4 个因素对黄酒中精氨酸形成和水解的影响，并建立起与氨基甲酸乙酯形成的相关性。乳酸菌具有较强的精氨酸代谢能力，有明显促进氨基甲酸乙酯形成的作用；而醪液pH 值越低，检测到的精氨酸浓度越低，低pH 值环境可以诱导乳酸菌代谢精氨酸脱亚胺，产生氨来提高环境的pH 值以更有利于菌的生长[12]，而代谢产生的瓜氨酸和氨甲酰磷酸都是形成氨基甲酸乙酯的前体物质，因此低pH 值醪液中的氨基甲酸乙酯含量显著升高。酵母菌对氨基甲酸乙酯的形成有明显的影响，不同菌株的精氨酸水解能力不同，产生尿素的量也就不一样，利用低水解酶活性的酵母酿酒，有利于控制产品中氨基甲酸乙酯的形成。红曲霉可以产生精氨酸，也可以水解精氨酸，因此添加红曲的黄酒中氨基甲酸乙酯含量明显高于不添加红曲的。

因此，使用特定的酿酒酵母，并在酿造过程中控制环境中乳酸菌进入醪液中，保持合适的pH 值等都是控制氨基甲酸乙酯形成的有效措施，结合产品现有生产工艺的调整，可以有效降低黄酒中氨基甲酸乙酯的含量。