不同寄主上南方根结线虫的ISSR—PCR鉴别

思彬彬+张学娟+张靠稳

摘要：以南方根结线虫雌虫DNA为基础，通过ISSR-PCR分子标记鉴别出寄生在黄瓜和番茄上的南方根结线虫。本试验中ISSR-PCR反应体系25 μL，各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通过对50个ISSR引物的筛选，得到1个引物841，该引物能将寄生在不同寄主上的南方根结线虫加以鉴别。

关键词：南方根结线虫；雌虫；ISSR-PCR；鉴别；引物

中图分类号： S432.4+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是一种分布广、危害严重的植物寄生线虫[1]，通过其在侵染的寄主植物上的寄生行为直接引起作物的产量损失。传统方法主要根据根结线虫形态学进行鉴定和分类，但由于其较大的变异性导致有时结果不够准确[2]。本试验将南方根结线虫形态学和 ISSR-PCR 分子标记的方法相结合，研究了贺兰山军马场不同寄主上南方根结线虫中种群的种类，为今后宁夏地区南方根结线虫病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 南方根结线虫样本的采集

2012年1月在贺兰山军马场温棚采集有大量根结的黄瓜根部组织；2012年7月分别在贺兰山军马场露天采集有大量根结的番茄根部组织。

1.2 南方根结线虫的形态学鉴定

依据参考文献[2]，分别观察黄瓜和番茄根结中的根结线虫雌虫会阴花纹。

1.3 2种寄主根部南方根结线虫DNA的提取

提取方法根据参考文献[3]

1.4 2种不同寄主上南方根结线虫的ISSR-PCR扩增

利用单因素试验与正交设计试验相结合的方法，建立并优化了根结线虫ISSR-PCR的体系。适用于南方根结线虫的25 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黄瓜与番茄根部南方根结线虫的ISSR-PCR鉴别

将取自黄瓜和番茄根部的南方根结线虫采用ISSR-PCR分子标记，利用50个引物进行筛选。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

依据参考文献[2]的方法，鉴别出所采黄瓜和番茄的根部样本中的根结线虫均为南方根结线虫。同时前人的研究结果也显示该地区的根结线虫为南方根结线虫。

2.2 ISSR-PCR扩增结果分析

由图1 可知，以不同寄主上的南方根结线虫DNA为模板，利用ISSR-PCR分子标记的方法，使用不同的引物对其进行扩增反应，结果显示，虽然形态学上雌虫的会阴花纹观察发现寄生在黄瓜和番茄根部的根结线虫均为南方根结线虫，但是利用ISSR-RCR分子标记发现，南方根结线虫在不同寄主上却存在差异性。本试验中筛选了50个引物，发现1个引物对不同寄主上的南方根结线虫扩增后存在差异性。

2.3 鉴别结果

在筛选的50个ISSR引物中，其中有1个引物841扩增的结果显示两者之间存在差异性（图2）。来自不同寄主的南方根结线虫，其会阴花纹均具背弓较高的特点，但其DNA水平上却存在差异。A泳道均为黄瓜根部的南方根结线虫，B泳道均为番茄根部的南方根结线虫，而引物841能将二者鉴别开来。

3 讨论

一直以来，会阴花纹在鉴定根结线虫的种的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究显示，会阴花纹存在较大的变异性，而ISSR-PCR能够帮助弥补会阴花纹变异所带来的鉴定局限性。与此同时，南方根结线虫具有4个生理小种，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小种。而本次试验采集黄瓜和番茄根部样品的季节不同，黄瓜是在冬季蔬菜温棚中采集的根部样本，而番茄却是在7月份的露天大田里采集的根部样本，所以，笔者推断ISSR-PCR结果之所以有差异性，可能是不同的生理小种造成的。以往对南方根结线虫生理小种的鉴别依据是鉴别寄主，本试验结果提示以后可以考虑利用ISSR-PCR鉴别南方根结线虫的生理小种；并且本试验结果也可为今后宁夏地区根结线虫病害的防治提供一定的理论依据。

参考文献：

[1]黄 利，王 宇，董林林，等. 南方根结线虫与秀丽线虫同源基因的鉴定及其应用分析[J]. 中国农业大学学报，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金铃，蒋 寒，孙龙华，等. 中国南方地区作物根结线虫种和小种的鉴定[J]. 华中农业大学学报，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，张靠稳，孟北乾. 雌根结线虫DNA的提取方法[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：27-28.

摘要：以南方根结线虫雌虫DNA为基础，通过ISSR-PCR分子标记鉴别出寄生在黄瓜和番茄上的南方根结线虫。本试验中ISSR-PCR反应体系25 μL，各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通过对50个ISSR引物的筛选，得到1个引物841，该引物能将寄生在不同寄主上的南方根结线虫加以鉴别。

关键词：南方根结线虫；雌虫；ISSR-PCR；鉴别；引物

中图分类号： S432.4+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是一种分布广、危害严重的植物寄生线虫[1]，通过其在侵染的寄主植物上的寄生行为直接引起作物的产量损失。传统方法主要根据根结线虫形态学进行鉴定和分类，但由于其较大的变异性导致有时结果不够准确[2]。本试验将南方根结线虫形态学和 ISSR-PCR 分子标记的方法相结合，研究了贺兰山军马场不同寄主上南方根结线虫中种群的种类，为今后宁夏地区南方根结线虫病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 南方根结线虫样本的采集

2012年1月在贺兰山军马场温棚采集有大量根结的黄瓜根部组织；2012年7月分别在贺兰山军马场露天采集有大量根结的番茄根部组织。

1.2 南方根结线虫的形态学鉴定

依据参考文献[2]，分别观察黄瓜和番茄根结中的根结线虫雌虫会阴花纹。

1.3 2种寄主根部南方根结线虫DNA的提取

提取方法根据参考文献[3]

1.4 2种不同寄主上南方根结线虫的ISSR-PCR扩增

利用单因素试验与正交设计试验相结合的方法，建立并优化了根结线虫ISSR-PCR的体系。适用于南方根结线虫的25 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黄瓜与番茄根部南方根结线虫的ISSR-PCR鉴别

将取自黄瓜和番茄根部的南方根结线虫采用ISSR-PCR分子标记，利用50个引物进行筛选。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

依据参考文献[2]的方法，鉴别出所采黄瓜和番茄的根部样本中的根结线虫均为南方根结线虫。同时前人的研究结果也显示该地区的根结线虫为南方根结线虫。

2.2 ISSR-PCR扩增结果分析

由图1 可知，以不同寄主上的南方根结线虫DNA为模板，利用ISSR-PCR分子标记的方法，使用不同的引物对其进行扩增反应，结果显示，虽然形态学上雌虫的会阴花纹观察发现寄生在黄瓜和番茄根部的根结线虫均为南方根结线虫，但是利用ISSR-RCR分子标记发现，南方根结线虫在不同寄主上却存在差异性。本试验中筛选了50个引物，发现1个引物对不同寄主上的南方根结线虫扩增后存在差异性。

2.3 鉴别结果

在筛选的50个ISSR引物中，其中有1个引物841扩增的结果显示两者之间存在差异性（图2）。来自不同寄主的南方根结线虫，其会阴花纹均具背弓较高的特点，但其DNA水平上却存在差异。A泳道均为黄瓜根部的南方根结线虫，B泳道均为番茄根部的南方根结线虫，而引物841能将二者鉴别开来。

3 讨论

一直以来，会阴花纹在鉴定根结线虫的种的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究显示，会阴花纹存在较大的变异性，而ISSR-PCR能够帮助弥补会阴花纹变异所带来的鉴定局限性。与此同时，南方根结线虫具有4个生理小种，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小种。而本次试验采集黄瓜和番茄根部样品的季节不同，黄瓜是在冬季蔬菜温棚中采集的根部样本，而番茄却是在7月份的露天大田里采集的根部样本，所以，笔者推断ISSR-PCR结果之所以有差异性，可能是不同的生理小种造成的。以往对南方根结线虫生理小种的鉴别依据是鉴别寄主，本试验结果提示以后可以考虑利用ISSR-PCR鉴别南方根结线虫的生理小种；并且本试验结果也可为今后宁夏地区根结线虫病害的防治提供一定的理论依据。

参考文献：

[1]黄 利，王 宇，董林林，等. 南方根结线虫与秀丽线虫同源基因的鉴定及其应用分析[J]. 中国农业大学学报，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金铃，蒋 寒，孙龙华，等. 中国南方地区作物根结线虫种和小种的鉴定[J]. 华中农业大学学报，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，张靠稳，孟北乾. 雌根结线虫DNA的提取方法[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：27-28.

摘要：以南方根结线虫雌虫DNA为基础，通过ISSR-PCR分子标记鉴别出寄生在黄瓜和番茄上的南方根结线虫。本试验中ISSR-PCR反应体系25 μL，各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通过对50个ISSR引物的筛选，得到1个引物841，该引物能将寄生在不同寄主上的南方根结线虫加以鉴别。

关键词：南方根结线虫；雌虫；ISSR-PCR；鉴别；引物

中图分类号： S432.4+5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根结线虫（Meloidogyne incognita）是一种分布广、危害严重的植物寄生线虫[1]，通过其在侵染的寄主植物上的寄生行为直接引起作物的产量损失。传统方法主要根据根结线虫形态学进行鉴定和分类，但由于其较大的变异性导致有时结果不够准确[2]。本试验将南方根结线虫形态学和 ISSR-PCR 分子标记的方法相结合，研究了贺兰山军马场不同寄主上南方根结线虫中种群的种类，为今后宁夏地区南方根结线虫病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 南方根结线虫样本的采集

2012年1月在贺兰山军马场温棚采集有大量根结的黄瓜根部组织；2012年7月分别在贺兰山军马场露天采集有大量根结的番茄根部组织。

1.2 南方根结线虫的形态学鉴定

依据参考文献[2]，分别观察黄瓜和番茄根结中的根结线虫雌虫会阴花纹。

1.3 2种寄主根部南方根结线虫DNA的提取

提取方法根据参考文献[3]

1.4 2种不同寄主上南方根结线虫的ISSR-PCR扩增

利用单因素试验与正交设计试验相结合的方法，建立并优化了根结线虫ISSR-PCR的体系。适用于南方根结线虫的25 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黄瓜与番茄根部南方根结线虫的ISSR-PCR鉴别

将取自黄瓜和番茄根部的南方根结线虫采用ISSR-PCR分子标记，利用50个引物进行筛选。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

依据参考文献[2]的方法，鉴别出所采黄瓜和番茄的根部样本中的根结线虫均为南方根结线虫。同时前人的研究结果也显示该地区的根结线虫为南方根结线虫。

2.2 ISSR-PCR扩增结果分析

由图1 可知，以不同寄主上的南方根结线虫DNA为模板，利用ISSR-PCR分子标记的方法，使用不同的引物对其进行扩增反应，结果显示，虽然形态学上雌虫的会阴花纹观察发现寄生在黄瓜和番茄根部的根结线虫均为南方根结线虫，但是利用ISSR-RCR分子标记发现，南方根结线虫在不同寄主上却存在差异性。本试验中筛选了50个引物，发现1个引物对不同寄主上的南方根结线虫扩增后存在差异性。

2.3 鉴别结果

在筛选的50个ISSR引物中，其中有1个引物841扩增的结果显示两者之间存在差异性（图2）。来自不同寄主的南方根结线虫，其会阴花纹均具背弓较高的特点，但其DNA水平上却存在差异。A泳道均为黄瓜根部的南方根结线虫，B泳道均为番茄根部的南方根结线虫，而引物841能将二者鉴别开来。

3 讨论

一直以来，会阴花纹在鉴定根结线虫的种的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究显示，会阴花纹存在较大的变异性，而ISSR-PCR能够帮助弥补会阴花纹变异所带来的鉴定局限性。与此同时，南方根结线虫具有4个生理小种，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小种。而本次试验采集黄瓜和番茄根部样品的季节不同，黄瓜是在冬季蔬菜温棚中采集的根部样本，而番茄却是在7月份的露天大田里采集的根部样本，所以，笔者推断ISSR-PCR结果之所以有差异性，可能是不同的生理小种造成的。以往对南方根结线虫生理小种的鉴别依据是鉴别寄主，本试验结果提示以后可以考虑利用ISSR-PCR鉴别南方根结线虫的生理小种；并且本试验结果也可为今后宁夏地区根结线虫病害的防治提供一定的理论依据。

参考文献：

[1]黄 利，王 宇，董林林，等. 南方根结线虫与秀丽线虫同源基因的鉴定及其应用分析[J]. 中国农业大学学报，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金铃，蒋 寒，孙龙华，等. 中国南方地区作物根结线虫种和小种的鉴定[J]. 华中农业大学学报，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，张靠稳，孟北乾. 雌根结线虫DNA的提取方法[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：27-28.