饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾生殖的影响

刘 燕，李宗锴*，韩 瑞，王 静，胡纯华，肖 春**

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 职业与继续教育学院，云南 昆明 650201)

0 前言

马铃薯块茎蛾(Phthorimaeaoperculella)是一种典型的寡食性害虫，寄主范围仅限于茄科植物，且最嗜食马铃薯块茎[1]。该虫是马铃薯种植业上的最重要害虫之一，在块茎贮存期为害尤其严重，其中贮存期超过半年以上的块茎被害率可达100%[2]。因此，研发安全、高效的防治技术，对于控制马铃薯块茎蛾的发生与为害极为重要。

性诱剂应用是防治害虫的重要技术之一，具有安全、高效、专一性强、不伤害天敌、不污染环境的优势。马铃薯块茎蛾的性信息素研究早有报道[3]，但性诱剂在生产实践中的应用效果极其少见[4]，原因可能和马铃薯块茎蛾存在着孤雌生殖的争论有关。因为性诱剂的作用方式是阻断昆虫两性之间的交配行为，进而达到降低害虫后代种群的目的。因此，性诱剂只适合应用于两性生殖的害虫种类的防治，对于具有孤雌生殖特性的种类则效果不佳[5]。

关于马铃薯块茎蛾是否存在着孤雌生殖现象一直存有争论。有报道显示，马铃薯块茎蛾的孤雌生殖率可达50%以上[6]，而有些研究则报道该虫并不存在孤雌生殖或者发生率极低[7]。最新研究结果显示，在马铃薯块茎蛾中确实存在着孤雌生殖现象；孤雌生殖的发生与块茎中的幼虫密度紧密相关[8]。也就是说诱发孤雌生殖的因素在幼虫体内就已经形成了。那么，这种因素是否会随粪便排出体外、并且具有影响雌虫孤雌生殖发生的活性？孤雌生殖个体的产卵特征是什么？回答这些问题将有助于进一步揭示马铃薯块茎蛾生殖方式转变及种群自我调节的机制。为此，作者开展了饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾生殖及产卵的影响的研究。

1 材料与方法

1.1 虫源

马铃薯块茎蛾采自云南省宣威市，幼虫以正常密度(15头/130 g块茎，ND)用马铃薯块茎饲养。当卵孵化后，将初孵幼虫接入到新鲜块茎上，之后幼虫会蛀入到块茎内取食、生长。将接有幼虫的块茎置于养虫笼(24 cm×24 cm×24 cm)内的细沙上。幼虫在取食过程中会从块茎中将粪便排出至块茎表面形成黑色块状物，老熟后从块茎中脱出并入沙、结茧、化蛹。成虫羽化后按1∶1配对置于产卵盒(Φ=13 cm，h=14.5 cm)中，成虫产卵于滤纸表面[9]。每天用10%蜂蜜水(FM)为成虫提供补充营养，并定时收集虫卵备用。室内环境条件：温度(25±2)℃，光周期L∶D = 14 h∶10 h，相对湿度为50%～70%。

按照上述方法，将初孵幼虫以高密度(45头/130 g块茎，HD)接入块茎中，之后4～6 d内收集幼虫产生的新鲜虫粪。取5 g新鲜虫粪和10 g蜂蜜加蒸馏水配制成100 mL溶液，充分搅拌后静置5 h得虫粪提取物(ELF)。将提取物过滤后取滤液于冰箱(<-5 ℃)中保存备用。

1.2 饲喂幼虫粪便提取物对孤雌生殖发生的影响

将马铃薯块茎(80±10)g置于220 mL纸杯中，并在杯中放置浸有4 mL补充营养液的棉团(Φ=1 cm)，将1头刚羽化的ND雌虫置于杯中并用尼龙纱网封口以阻隔雌虫与雄虫的接触。8 d后观察马铃薯上有无幼虫粪便出现，有虫粪者视为孤雌生殖发生。之后将有虫粪的块茎移入到养虫笼中，直至蛹出现，待成虫羽化后记录雌雄比。

利用上述方法，分别测定：ND雌虫+10%蜂蜜水(对照，ND/FM)、ND雌虫+虫粪提取物(ND/ELF)、HD雌虫+10%蜂蜜水(HD/FM)等3种组合下雌虫的孤雌生殖率。每处理观察30头雌虫，重复4次。

1.3 饲喂幼虫粪便提取物对雌虫产卵量及卵粒的影响

1.3.1 对未交配雌虫产卵的影响 采用步骤1.2的方法用幼虫粪便提取物饲喂雌虫。将5头刚羽化的ND雌虫置于产卵盒中，每天饲喂4 mL幼虫粪便提取物(ELF)，分别以喂食4 mL蜂蜜水的ND雌虫和HD雌虫为对照。每天收取卵粒，直至雌虫死亡。使用体视显微镜检查卵的外观并统计卵量。重复4次。

雌虫卵粒从外观上看可分为3类：正常卵、畸形卵和干瘪卵。正常卵饱满，椭圆形；畸形卵表面严重凹陷、有皱褶；干瘪卵只剩卵壳，也称无效卵(图1)。

1.3.2 对已交配雌虫产卵的影响 将1日龄ND雌虫、ND雄虫分别置于产卵笼中喂食幼虫粪便提取物(ELF)并保持1 d，之后取5对雌、雄虫(2日龄)按1∶1比例配对置于其它产卵盒中，喂以蜂蜜水。另外分别取5头雌、雄虫(ND/ELF)与同日龄异性(ND/FM，仅取食蜂蜜)按1∶1比例配对后置于产卵盒中，每天喂以蜂蜜水。重复4次。

另取5对2日龄ND雌雄虫(仅喂食蜂蜜，CK1)、5对2日龄HD雌雄虫(仅喂食蜂蜜，CK2)分别置于产卵盒中以便完成交配、产卵。每天喂以蜂蜜水(FM)。重复4次。次日开始收集卵粒，直到雌虫死亡，统计单雌产卵量和孵化率。

1.4 数据分析

采用统计软件SPSS 17.0进行实验数据分析，利用Duncan检验进行差异显著性分析(ANOVA，α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾孤雌生殖发生的影响

实验结果如表1所示，以正常密度[15头/(130±2)g块茎，ND]饲养幼虫时，在马铃薯块茎蛾中不会出现孤雌生殖现象；而以高密度[45头/(130±2)g块茎，HD]饲养幼虫时，雌蛾的孤雌生殖率可达10%左右，且以孤雌生殖模式所繁殖的后代雌雄比为1.4。用正常密度饲养幼虫获得的雌蛾，如果喂以高密度幼虫的粪便提取物(ELF),则可诱发孤雌生殖的发生，其发生率可达2.5%左右，而且由孤雌生殖而来的后代雌雄比为2.0。

2.2 饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾产卵的影响

2.2.1 饲喂幼虫粪便提取物对未交配雌虫产卵的影响 从实验结果可以看出，未交配雌蛾产的正常卵外观饱满，卵黄明显，呈椭圆形；而畸形卵表面通常有凹陷、皱褶，卵黄明显；无效卵仅有卵壳，内无明显卵黄(图1)。其中无效卵为主要类型，正常卵所占比例最低(表2)。

1.正常卵；2.畸形卵；3.干瘪卵。

表1 饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾孤雌生殖发生的影响

注：数字后面的字母a、b、c表示不同处理间的差异显著性(方差齐性检验，df1=2，df2=9，P=0.184；ANOVA，F=31.978，P<0.001)。

在没有交配的条件下，不论是由正常密度还是高密度幼虫饲养而获得的雌虫产卵量均较低，单雌产卵量不超过20粒；而在饲喂ELF后，ND雌虫产卵量也极低(平均19.6粒)，与前两者不存在显著差异(表2)。

在仅喂食蜂蜜时，HD雌虫产生的卵粒中正常卵粒所占比例显著高于ND雌虫。而ND雌虫在取食ELF后正常卵粒所占比例得到显著提高(表2)。

表2 饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾未交配雌虫产卵的影响

注：字母a、b、c表示不同处理间的差异显著性(α=0.05)。其中，正常卵(方差齐性检验，df1=2，df2=9，pP=0.619；ANOVA，F=6.523，P=0.018)，无效卵(方差齐性检验，df1=2，df2=9，P=0.995；ANOVA，F=5.056，P=0.034)。

实验结果也同时显示，在未交配状态下ND雌虫(仅喂食蜂蜜)所产出的卵中无效卵比例高达77.6%，显著高于HD雌蛾(仅喂食蜂蜜)的66.4%。而喂食ELF的ND雌蛾产下的卵粒中无效卵占73.6%，与另外两种处理均无显著差异(表2)。畸形卵在总卵粒中所占比例在3种处理间均不存在显著差异(表2)。

2.2.2 饲喂幼虫粪便提取物对交配雌虫产卵的影响 从单雌产卵量来看，HD雌虫(CK2)在交配后的产卵量最低，仅为142±16.7粒，显著低于ND雌虫(CK1)的211±20.3粒。如果单独给ND雌虫、ND雄虫喂ELF，或者同时给ND雌雄虫喂食ELF，则雌虫交配后的落卵量与对照(CK1)相比均无显著差异。但如果让ND雌雄虫同时取食ELF后再进行交配，则雌虫单雌产卵量可达233.0±18.0粒，显著高于HD雌虫(CK2)的产卵量，而与ND雌虫(CK1)无显著差异(表3)。

在仅喂食蜂蜜的条件下，HD雌虫(CK2)卵的孵化率最低，仅为(81.8±1.4)%，显著低于ND雌虫(CK1)的(92.6±0.9)%。与对照(CK1)相比，ND雄虫在取食ELF后若再与雌虫(仅喂食蜂蜜)交配，则卵孵化率仅为(82.0±2.3)%，显著低于CK1的(92.6±0.9)%，与CK2的(81.8±1.4)%无显著差异。如果让ND雌虫取食ELF后与ND雄虫(仅喂食蜂蜜)、或者ND雌雄虫同时取食ELF，则卵孵化率均与CK1无显著差异(表3)。

至于雌虫所产畸形卵量，在各处理间均无显著差异。

3 讨论

孤雌生殖是昆虫中比较常见的一种生殖方式。有许多种类既可以行两性生殖，也可行孤雌生殖[10,11]。许多研究结果表明，孤雌生殖的发生是对极端环境的一种适应，比如应对食物/寄主匮乏[12,13]、适应高温[14]等。

表3 饲喂幼虫粪便提取物对马铃薯块茎蛾交配雌虫产卵的影响

注：孵化率是指全部落卵的孵化率。字母a、b、c表示不同处理间的差异显著性(α=0.05)，其中单雌产卵量(方差齐性检验，df1=4，df2=15，P=0.822；ANOVA，F=4.059，P=0.02)，畸形率为(方差齐性检验，df1=4，df2=15，P=0.161；ANOVA，F=1.524，P=0.245)，孵化率(方差齐性检验，df1=4，df2=15，P=0.605；ANOVA，F=9.965，P<0.0001)。

在马铃薯块茎蛾中，孤雌生殖只有在块茎幼虫数量超过一定限度时才会产生[8]。这说明孤雌生殖产生主要是为了应对食物资源匮乏而采取的一种生殖策略。我们的实验结果显示，喂食高密度幼虫产生的粪便提取物ELF能够诱发孤雌生殖现象的发生(表1)。这一事实说明孤雌生殖诱发因子(Parthenogenesis-inducing factors, PIF)在幼虫期内即开始发挥作用。这也同时说明，这些诱发因素(PIF)可能随幼虫粪便排除体外。这显示诱发因素可能存在于肠道中，甚至可能与肠道中的微生物有关[14,15]。实验结果显示，在未交配时，不论是正常密度幼虫饲养、还是高密度幼虫饲养所获得的雌虫，其产卵量均很低；在给正常密度雌蛾喂食幼虫粪便提取物ELF后，未交配雌虫的产卵量也与前两者没有显著差异(表2)。这说明，PIF没有刺激雌虫产卵的功效。

那么，当环境改变后、昆虫体内的诱发因素PIF被激活时，会使马铃薯块茎蛾产卵发生哪些变化呢？ 从实验结果(表2)可以看出，幼虫高密度饲养时，未交配雌蛾产下的正常卵量显著高于正常密度饲养的雌蛾，由高密度幼虫羽化而来的处女雌蛾(HD♀)产下的正常卵粒可达总卵量的4.5%左右，远高于正常密度雌虫(ND♀)的1.7%。更进一步观察显示，当诱发因子PIF进入ND♀体内后，则可诱使未交配雌蛾体内正常卵粒的比例显著增加。如ND♀在取食幼虫粪便提取物(ELF)后，正常卵粒比例亦得到显著升高，达到3.9%(表2)。这在一定程度上说明，诱发因子PIF具有促进卵粒发育的作用，而正常卵粒的增加正是孤雌生殖发生的物质基础。这说明虫体内诱发因子PIF可能参与了卵母细胞发育的调控。这与有关报道的结果较相似[16]。

更进一步的结果显示，与对照(CK1)相比，在交配前，不论是给ND♀还是ND♂，或者同时给ND♀、ND♂喂食幼虫粪便提取物，则ND成虫交配后的单雌产卵量均无显著变化(表3)。这进一步说明，PIF不会刺激雌蛾产卵。

有意思的是，喂食ELF虽然不会刺激雌虫产卵，但是实验结果证实，给予ND♂喂食ELF后再与未接触过ELF的ND♀交配，则造成卵孵化率显著下降(表3)。这说明，PIF在一定程度上具有抑制雄虫生殖力的作用。这种现象在其它昆虫的孤雌生殖现象中也存在[17]。

综上所述，孤雌生殖的发生是马铃薯块茎蛾对不利环境的一种适应性表现。即在食物极端匮乏的情形下，为了降低种内竞争、保持种群顺利繁衍，种群必须降低自身繁殖力，以实现有限资源的高效利用[18]。而降低种群自身繁殖力是通过PIF来进行调节的，PIF被激活后，可以促进卵粒的发育，以提高孤雌生殖的效率；且交配会显著提高雌虫的产卵量，而PIF被激活后，雄虫的生殖潜力会受到显著抑制，从而导致种群繁殖力下降。但马铃薯块茎蛾体内的PIF究竟是什么，尚需要进行更深入的研究。