两波长变化HPLC法同时测定护肝片中5种主要成分的含量

唐 霄 ，张翠欣（河北医科大学第三医院临床药学部，河北 石家庄 050051）

护肝片是由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉和绿豆6味药材制成的中成药，临床上可用于慢性肝炎和早期肝硬化的治疗，也是肝移植术后常用的保肝药物。茵陈作为护肝片的主药之一，具有清湿热、退黄疸的功效，能够增加胆汁分泌，并参与胆汁酸及某些有毒物质的代谢，其主要酚酸类成分绿原酸具有保肝利胆、抗菌消炎的作用[1-3]。绿豆中的黄酮类成分可以缓解急性酒精性肝损伤[4]，牡荆苷是绿豆中重要的黄酮类成分，能够提高肝脏抗氧化能力，清除羟基自由基，减轻肝细胞损伤[5]。2015版药典仅将五味子醇甲作为护肝片含量测定的标准，对于其他成分的含量未见规定[6]。本文对护肝片中绿原酸、牡荆苷、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素进行同时测定，为改进护肝片的质量标准提供技术基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司，包括G1311A四元泵、G1322A在线脱气机、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B二极管阵列检测器、Agilent色谱工作站）；AX205型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；HS2060型超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）。

1.2 试剂与药品

护肝片（黑龙江葵花药业股份有限公司，批号201610051，201703067，201801033）；对照品绿原酸（批号110753-201817，含量96.8%）、牡荆苷（批号111687-201704，含量94.9%）、五味子醇甲（批号110857-201714，含量99.9%）、五味子甲素（批号110764-201714，含量99.3%）、五味子乙素（批号110765-201512，含量99.0%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；磷酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱（见表1）；流速：1 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：0 ～ 20 min为340 nm，20 ～ 40 min为254 nm；进样量：20 μL。理论塔板数以五味子醇甲计应不低于3000。

表 1 流动相梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别取绿原酸、牡荆苷、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成浓度为0.4、0.2、0.7、0.5、0.4 mg·mL-1的储备液。精密量取各对照品储备液，加甲醇稀释，制成质量浓度分别为0.080 0、0.040 0、0.122 5、0.037 5、0.040 0 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取护肝片10片，除去包衣，粉碎，取0.35 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入体积分数为50%的甲醇20 mL，称量，超声提取（60 W，频率40 kHz）30 min，放冷至室温，再次称量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例取不含茵陈、五味子和绿豆的其他药材，按照护肝片的制备工艺制成阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性实验

分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析。对照品和供试品中的各成分与其相邻色谱峰均能实现良好分离，且分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图A - 混合对照品，B - 阴性对照样品，C - 样品；1 - 绿原酸，2 - 牡荆苷，3 - 五味子醇甲，4 - 五味子甲素，5 - 五味子乙素Fig 1 HPLC chromatogramsA - mixed reference substance, B - negative control, C - sample; 1- chlorogenic acid, 2 - vitexin, 3 - schisandrol A, 4 - schisandrin A, 5 - schisandrin B

2.4 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液，加50%甲醇稀释1倍、2倍、4倍、8倍、16倍，即得系列浓度溶液，各取20 μL进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算各成分的回归方程和相关系数（r）。结果表明，5种成分在各自浓度范围内线性关系良好，r ≥ 0.999 9，见表2。

表2 护肝片中5种成分的回归方程、相关系数和线性范围Tab 2 Regression equation, correlation coefficient and linear range of five components in Hugan tablets

2.5 精密度试验

取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，考察精密度。重复进样6次，绿原酸、牡荆苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为2.52%、1.63%、1.08%、3.30%和0.65%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批次护肝片，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样分析，考察方法的重复性。绿原酸、牡荆苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为1.97%、1.89%、0.65%、2.72%、1.68%，表明本方法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于配制后0、3、6、9、12、24 h进样分析，测定各成分的峰面积。绿原酸、牡荆苷、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为1.48%、1.66%、0.70%、2.87%、0.93%，表明供试品中待测成分在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批护肝片粉末6份，每份约0.175 g，各置于锥形瓶中，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件分别进样20 μL，计算回收率。结果见表3。

2.9 样品含量测定

取3个批次的护肝片，每个批次按“2.2.2”项下方法制备3份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别计算5种成分的含量。3个批次护肝片含量测定结果见表4。其中五味子醇甲的含量符合药典标准（0.28 mg·片-1）。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

绿原酸、牡荆苷、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均能溶于甲醇，且绿原酸含有羧酸结构，极性较大，选用不同的提取溶剂（50%、75%、100%甲醇）进行试验，结果表明，使用50%甲醇提取可使绿原酸的峰形最高，且其他成分都能获得良好的峰形。此外，还考察了溶剂用量（15、20、30、50 mL）和超声时间（20、30、40 min）对实验结果的影响，发现使用20 mL 50%甲醇超声提取30 min可获得最佳提取结果。

表3 护肝片中5种成分的回收率Tab 3 Recovery rate of five components in Hugan tablets

表4 样品含量测定结果. mg·片-1Tab 4 Determination results of sample content. mg·tablet-1

3.2 流动相的选择

在护肝片的含量测定中，之前的文献大多采用乙腈作为流动相[7-10]，但乙腈价格昂贵，毒性大，本实验证实采用价格低廉且低毒的甲醇作为流动相也可以获得良好的峰形。绿原酸为有机酸，在酸性环境中比较稳定，在水系中添加少量磷酸可使绿原酸获得较好的峰形。比较了磷酸浓度为0.05%、0.10%、0.20%、0.30%时的实验结果，发现磷酸浓度为0.05%时色谱峰峰形差，使用0.2%磷酸获得的峰形最好，因此确定流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液。另外，ZORBAXSB-C18柱能够耐受pH≥1的偏酸性环境，0.2%磷酸水溶液的pH值大约为1.95，所以使用该色谱柱可以满足试验需求。

3.3 柱温的选择

对于柱温的选择，考察了柱温为25、30、35 ℃时的色谱图，随着温度升高，色谱峰保留时间缩短，柱温为35 ℃时峰形良好，因此确定柱温为35 ℃。

3.4 检测波长的选择

根据2015版中国药典[6]及相关文献[11-13]，绿原酸的最大吸收波长在327 nm，牡荆苷在340 nm，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素在254 nm附近，由于绿原酸与牡荆苷的最大吸收波长相近，在327 nm波长下，牡荆苷的峰值较低，在340 nm时，绿原酸与牡荆苷的峰值均较好，因此确定检测波长0 ～ 20 min为340 nm、20 ～ 40 min为254 nm。

综上，中药制剂所含成分复杂，其药理作用是所有药材共同作用的结果，同时测定制剂中多种药材主要成分的含量对于研究其体外和体内作用具有重要意义。已有文献有测定护肝片中多种五味子木脂素的报道[7]，也有测定绿原酸的报道[8-9]，但对于护肝片中牡荆苷的含量测定报道较少。本文选取护肝片中三种药材的5种有效成分进行含量测定，并且采用甲醇作为流动相，能够降低检测成本，测定方法简便，材料易得，为护肝片的含量测定提供了新思路。