反相高效液相色谱法测定老年癫痫患者血清中丙戊酸的浓度

黄芳华，陈红君，唐原君，朱李飞，余自成（．同济大学附属杨浦医院药学部，上海 00090；．上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海 00080）

丙戊酸制剂是疗效较好的一线广谱抗癫痫药，特别在老年癫痫患者中使用更为广泛[1]。但其安全范围窄，易引起胃肠道、共济失调、甚至肝损伤[2]等不良反应，且老年癫痫患者的药代动力学受生理状况、并发疾病以及合并用药等多种因素影响变异更大，使用丙戊酸制剂更需要测定血药浓度，进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）。丙戊酸血药浓度的测定方法目前常用的有免疫法、高效液相色谱法（HPLC）等[3-5]，其方法各有利弊。笔者通过对HPLC色谱条件和样品处理方法的改进，以ω-溴苯乙酮为丙戊酸的衍生化试剂，环己烷羧酸为内标，建立了反相高效液相色谱法测定丙戊酸的血药浓度，并成功测定了64例老年癫痫患者使用丙戊酸制剂的稳态谷浓度，为其个体化用药提供了支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱系统（Waters）：包括1525二元泵、2489紫外检测器、2707自动进样器、智能柱温箱、BreezeTMSoftware色谱工作站；MS204S型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；超纯水仪（Synergy UV系统，美国Millipore公司）；Allegra X-30R超速冷冻离心机（贝克曼库尔特有限公司）；MIXER-UZUSIO VTX-3000 L旋涡混合器（上海飞域国际贸易有限公司）。

1.2 试药

丙戊酸钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100963-20170606，纯度：99.0%）；环己烷羧酸（西格玛奥德里奇贸易有限公司，批号：101360309，纯度：98%）；ω-溴苯乙酮（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160215，纯度96%）；甲醇（Merck公司，HPLC级）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

精密称取丙戊酸钠对照品23.51 mg（以丙戊酸计为20.20 mg），置于10 mL棕色量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，即得以丙戊酸计浓度为2.02 mg·mL-1的对照品储备液，-20 ℃冰箱保存。

精密称取环己烷羧酸4 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加0.2 mol·L-1氨水溶解并定容，摇匀，即得环己烷羧酸浓度为0.4 mg·mL-1的内标储备液，-20 ℃冰箱保存。

精密称取ω-溴苯乙酮50 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加乙腈溶解并定容，摇匀，既得ω-溴苯乙酮浓度为5 mg·mL-1的衍生化试剂，-20 ℃冰箱保存。

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇:水= 82∶18（V∶V），等度洗脱；流速1 mL·mL-1；检测波长248 nm；柱温35 ℃；进样时间10 min；进样量20 μL；内标为环己烷羧酸。

2.3 血清样品预处理

精密吸取取样品血清100 μL，加内标液环己烷羧酸（0.4 mg·mL-1）50 μL后，再加1 mol·L-1的硫酸100 μL，混合摇匀，加入正己烷1 mL，于药用振荡器振摇10 min，13 000 r·min-1，20 ℃，离心5 min，精密吸取上清液860 μL，转移至另一干净试管中，加入20 μL的衍生化试剂（5 mg·mL-1的ω-溴苯乙酮）和10 μL碱化试剂（20%三乙胺），摇匀，置60 ℃水浴衍生化反应10 min，氮气吹干。残渣溶于120 μL流动相中，涡旋30 s，13 000 r·min-1，20 ℃，离心5 min，取20 μL进样分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法专属性 在本实验条件下，丙戊酸衍生物与内标衍生物能够得到良好的分离，丙戊酸及内标衍生物的保留时间分别为（8.63±0.14）min和（6.15±0.11）min，样品峰型良好。在此条件下，血清内源性物质以及临床可能合用的苯妥英钠、苯巴比妥、卡马西平、艾司唑仑等药物对本法测定均无干扰，具有较好的特异性。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图A - 空白血清，B -空白血清+丙戊酸+内标，C -患者服用丙戊酸后的血清样品；1 -内标，2 -丙戊酸Fig 1 HPLC chromatogramsA - blank serum, B - blank serum + valproic acid + IS, C - patient's serum after valproic acid administration; 1 - IS; 2 - valproic acid

2.4.2 标准曲线与定量下限 精密吸取“2.1溶液配制”项下丙戊酸钠对照品溶液。用空白血清配制成含丙戊酸浓度为1.01、2.02、5.05、10.10、20.20、50.50、101.00、202.00 μg·mL-1的标准血清样品，按上述“2.3血清样品预处理”方法操作后进样测定。分别以丙戊酸衍生物的峰面积与内标衍生物峰面积的比值（As/Ai）对应丙戊酸质量浓度（C）进行线性回归，得丙戊酸浓度测定的标准曲线方程为：As/Ai= 2.23×10-3C + 1.17×10-2，r2= 0.999 5（n = 5，每个点取5份溶液测定取平均值）。结果表明，丙戊酸浓度在1.01 ～ 202.00 μg·mL-1范围内测定线性关系良好。配制一定浓度的丙戊酸样品，按基线噪音的3倍为检测限，测得丙戊酸的检测限为 0.505 μg·mL-1。

2.4.3 回收率与精密度 按“2.4.2”项下方法配制含丙戊酸浓度分别为2.02、20.20、161.60 μg·mL-1的低、中、高三种浓度的质控样品，每个浓度平行配制5份，按上述“2.3”项下方法操作后进样测定。由实测浓度与配制浓度的比值计算回收率，并计算日内精密度。将低、中、高三个浓度的质控样品连续五天进行测定，每次每个浓度测定五份，计算日间精密度。结果见表1。

表1 HPLC法测定人血清中丙戊酸的方法回收率和精密度. n = 5Tab 1 Method recovery and precision of valproic acid determination in human serum. n = 5

2.4.4 稳定性试验 本实验主要考察了丙戊酸质控血清样品室温放置12 h、反复冻融3次、密封低温保存（-70 ℃）1个月的稳定性。取低、中、高浓度的质控血清样品进行稳定性试验，进样测定，每次平行测定5份样品。结果表明，丙戊酸血清样品在室温放置4 h、预处理后自动进样器放置12 h、冻融3次和密封低温保存（-70 ℃）3个月等条件下回收率均为85% ～115%，RSD均＜ 15%。

2.5 临床应用

选择我院神经内科服用丙戊酸制剂的癫痫患者64例，其中男性27例，女性37例，平均年龄（71.08±13.47）岁，患者服用丙戊酸制剂达稳态血药浓度后（5 ～ 7个半衰期），采集谷浓度使用本方法进行测定。丙戊酸有效血药浓度参考范围为50 ～ 100 μg·mL-1，小于50 μg·mL-1为低于有效浓度范围，大于100 μg·mL-1为中毒浓度范围，64例患者丙戊酸血药浓度监测结果见表2。结果表明，丙戊酸治疗窗较窄，在患者服用该药期间应密切关注其血药浓度，以期达到个体化给药的目的。

表2 64例患者血清中丙戊酸浓度监测结果Tab 2 Results of serum concentration of valproic acid in 64 epileptic patients

3 讨论

由于丙戊酸分子结构中不含有紫外特征吸收基团，难以用高效液相色谱法直接测定。因此，本研究参考相关文献[6-7]，在三乙胺的催化条件下，以环己烷羧酸为内标，将样品中加入ω-溴苯乙酮进行衍生化反应，使其连接上紫外吸收的基团。为了提高检测的灵敏度，笔者对衍生化试剂和催化剂的浓度、用量、衍生时间等进行摸索，最终确定衍生化试剂选择5 mg·mL-1的ω-溴苯乙酮，加入量为20 μL，催化剂选择20%三乙胺，加入量10 μL，衍生时间10 min，此时反应完全彻底，衍生化效率最高，结果稳定可靠；衍生产物采用正己烷提取，氮气吹干；复溶进样后，在优化的色谱条件下，峰形以及分离度良好，且保留时间均小于10 min，有机流动相使用甲醇，该方法具有低成本、高效的优点。

用本法监测了我院老年癫痫患者常规剂量或经验医嘱使用丙戊酸制剂后的稳态血药谷浓度，结果显示浓度范围为11.5 ～ 137.0 μg·mL-1，相差可达10倍之多，有效治疗范围内的仅占总数的40.63%，其中2例患者未能有效控制癫痫症状，5例患者出现皮疹、恶心等轻度不良反应；有42.19%的患者血药浓度未达到有效浓度范围，其中19例癫痫症状控制不佳，4例主诉恶心，自行停药；在超过有效血药浓度的11例患者中，有1例癫痫症状不能控制，6例出现恶心、皮疹、嗜睡、肝转氨酶升高等轻度不良反应，1例出现恶性发热及肝功能损害，不良反应发生率达73%，且存在严重不良反应。表明老年癫痫患者在常规剂量或经验医嘱下使用丙戊酸钠的体内药动学差异更大[8]，其疗效以及不良反应的发生与血药浓度之间存在较好的相关性。

老年癫痫患者本身生理情况与儿童、青年等群体有明显差异，又多同时患有多种基础疾病，如本法监测的64例患者中，2/3的患者同时患有心脑血管疾病，长期合并使用降压药、降糖药、调血脂药、抗血小板药、抗凝药、 中成药等，患者用药依从性不佳导致漏服，自行停药的现象明显增多；在同时合并使用抗感染药物的患者中，近1/3的患者在抗感染治疗时选用了喹诺酮类或碳青霉烯类，前者本身易诱发癫痫[9]，后者与丙戊酸存在复杂的相互作用[10]。血药浓度监测结果在提高老年癫痫患者的依从性，复杂病情下个体化用药方面，提供了必要的支持，临床药师根据血药浓度监测结果，结合患者的个体情况，对自行停药且癫痫症状控制不好的患者进行用药教育，恢复给药，对浓度不达标且症状控制不好或不良反应严重的患者，结合药动学模型，协助医生优化给药方案，最终取得了良好的治疗效果。