嗜酸乳杆菌LA-G80发酵培养基的优化

陈 齐，马章献，郑建丰*，韩 迪

（润盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属于革兰氏阳性细菌，具有多种生理功能[1-3]，如维持肠道菌群平衡、增强免疫力[4-5]、抑制有害菌生长[6]、控制胆固醇水平等作用[7-8]。嗜酸乳杆菌是功能性食品中的益生菌种之一[9]，获得美国食品药品监督管理局和我国卫生部授权。嗜酸乳杆菌培养过程中对环境及营养的要求较高[10]，研究高密度生产所需的培养基配方、培养工艺[11]、提高发酵活菌水平[12]是制备高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的关键。本研究利用单因素试验、正交试验、最陡爬坡试验及响应面优化等方法[13-14]对嗜酸乳杆菌LA-G80的培养工艺进行优化研究，得到嗜酸乳杆菌LA-G80发酵的最佳培养基组成及培养条件，为企业高质量、高活菌水平生产提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

嗜酸乳杆菌LA-G80分离自人体肠道菌群，由润盈生物工程（上海）有限公司研发中心实验室乳酸菌菌种资源库提供。

MRS液体培养基，按照GB 4789.35—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[15]的方法配制。

1.2 仪器与设备

JH UV-2102C紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BioFlo®/CelliGen 115®生物反应器 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及种子培养

菌种活化：取嗜酸乳杆菌LA-G80脱脂乳冻干管接入MRS液体培养基中，37℃培养12h，活化3 代。

种子培养：将活化后的菌种按体积分数2%接种到装有200 mL MRS培养基的250 mL三角瓶中，置于37℃培养箱中，普通培养8h。

1.3.2 嗜酸乳杆菌LA-G80三角瓶发酵及发酵液活菌计数

将达标的种子按体积分数2%接种到装有200 mL培养基的250 mL三角瓶中，置于37℃培养箱中，普通培养12h。发酵液活菌计数采用稀释倾注培养的方式，参照GB 4789.34—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定》[16]。

1.3.3 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基成分优化

以MRS液体培养基作为起始培养基，选择添加量均为20 g/L的蔗糖、大豆低聚糖、低聚半乳糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、大豆纤维素作为碳源，进行碳源优化实验；选择添加量均为10 g/L的牛肉浸粉、酵母粉、牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、脱盐乳清粉、酪蛋白胨、乳清粉、酵母蛋白胨进行氮源优化实验；选择添加量均为0.2 g/L的天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸和组氨酸进行氨基酸优化实验。在三角瓶中进行实验，于37℃普通培养12h进行发酵液活菌计数，初步确定培养基成分。

在上述优化后的培养基基础上，分别添加5 g/L花生粉646、花生蛋白粉542、豆粕粉850、豆饼粉742、大豆蛋白粉858、大豆蛋白粉740、蛋白粉MZ9508、棉籽饼粉MZ9541、小麦胚芽粉9 种营养丰富的粗料，考察发酵液活菌数，确定嗜酸乳杆菌LA-G80培养基中主要成分的最优配比。

1.3.4 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基主成分比例优化

根据培养基成分优化结果，选择效果最好的碳源、氮源及粗料3 种因素进行最陡爬坡试验及中心组合设计（central composite design，CCD），进行响应面拟合优化分析，得到碳源、氮源及粗料的最佳添加量。

1.3.5 嗜酸乳杆菌LA-G80三角瓶培养条件优化

考察不同培养温度、初始pH值和接种量对嗜酸乳杆菌LA-G80生长情况的影响，确定较优的三角瓶培养条件。

1.3.6 发酵罐验证

进行5 L规模小试发酵实验，将达标的种子接种到装有4 L培养基的5 L罐中，恒温（37℃）及搅拌（100 r/min）条件下培养14h，取样检测发酵液活菌数，验证优化后的培养基配方及培养条件。

1.4 数据处理

实验均重复测定2 次，取平均值。采用WPS 2016软件对培养基成分优化实验数据进行汇总及分析，利用Design Expert 8.0软件对培养基主成分比例优化实验数据进行方差分析、响应面预测及绘图。

2 结果与分析

2.1 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基优化结果

2.1.1 碳源优化结果

碳源是培养基中主要的能量来源，碳源的充足与多样性影响菌体的生长速率与菌体形态，多种碳源综合使用有利于菌体的均衡生长，是影响发酵液活菌数和冻干粉质量的重要因素。

图1 不同碳源（20 g/L）对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液活菌数的影响Fig.1 Effect of different carbon sources(20 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

由图1可知，以葡萄糖、麦芽糖或大豆低聚糖为碳源时，嗜酸乳杆菌LA-G80生长效果较好，对三者进行正交试验。

由表1可知，根据3 种碳源极差值的区别得到3 种碳源的影响程度为葡萄糖＞麦芽糖＞大豆低聚糖，最优组合为葡萄糖添加量40 g/L、麦芽糖20 g/L、大豆低聚糖10 g/L。按照最优组合的碳源添加量进行实验，嗜酸乳杆菌LA-G80的发酵液活菌数最高可达5.9×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳杆菌LA-G80碳源优化正交试验Table1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of mixed carbon sources for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.2 氮源优化结果

氮源是细胞合成核苷酸和蛋白质的重要原料物质，充足且易利用的氮源有利于细胞的快速分裂；蛋白胨类物质富含氨基酸、多肽、糖类、脂肪和生长因子等成分，能很好地促进嗜酸乳杆菌LA-G80的生长。

图2 不同氮源（10 g/L）对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液活菌数的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources(10 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

选择9 种不同氮源进行氮源优化实验，MRS对照组碳源按照优化后的比例进行配制。由图2可知，牛肉浸粉、胰蛋白胨和酵母蛋白胨为氮源时，嗜酸乳杆菌LA-G80培养效果较好。

在微生物生长过程中，多种氮源的复合使用更有利于细胞生长，考察复合氮源对嗜酸乳杆菌LA-G80生长的影响，设计正交试验。由表2可知，3 种氮源的影响顺序为牛肉浸粉＞胰蛋白胨＞酵母蛋白胨，较优组合为牛肉浸粉添加量15 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨15 g/L。按照最优组合的碳源及氮源添加量进行实验，发酵液活菌数最高可达7.9×108CFU/mL。

表2 嗜酸乳杆菌LA-G80氮源优化正交试验Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of mixed nitrogen sources for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.3 氨基酸优化结果

嗜酸乳杆菌LA-G80菌体细胞内缺乏各种必需的生物合成系统，依赖于培养基提供某些生长必需氨基酸，且可提高氮源利用率。在有氨基酸的培养过程中，乳酸菌可吸收相容性物质，以此加强水分子与胞内生物大分子物质的亲和力，进而保持蛋白质结构和酶活性，从而提高菌株冻干过程的存活率。在上述优化的基础上，选择9 种氨基酸，添加量均为0.2 g/L，考察嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液活菌数。

图3 不同氨基酸（0.2 g/L）对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液活菌数的影响Fig.3 Effect of different amino acids(0.2 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

由图3可知，与对照组相比，添加0.2 g/L天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸均能促进嗜酸乳杆菌LA-G80的生长，对三者添加量进行组合试验，进一步确定3 种氨基酸的较适添加量。

由表3可知，随着3 种氨基酸添加量的增多，嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液活菌数先上升后下降，最高发酵液活菌数为9.9×108CFU/mL，此时3 种氨基酸添加量均为0.16 g/L。

表3 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基氨基酸优化组合试验设计及结果Table3 Combined test design with experimental results for optimization of mixed amino acids for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.4 粗料优化结果

表4 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基粗料（5 g/L）优化结果Table4 Selection of optimal solid culture substrate(5 g/L)for Lactobacillus acidophilus LA-G80

在微生物培养中，粗料作为一类营养丰富、含促生长因子、价格便宜的物质被大量利用。由表4可知，添加5 g/L 9 种粗料均对嗜酸乳杆菌LA-G80的生长有促进作用，其中添加豆饼粉742和花生蛋白粉542的效果最好，发酵液活菌数可分别达到16.2×108、15.3×108CFU/mL，且菌体形态更加均一，有利于提高菌体密度和菌泥产量。

2.2 响应面法优化嗜酸乳杆菌LA-G80培养基主成分比例

通过碳源、氮源及粗料添加试验后，确定葡萄糖、牛肉浸粉及豆饼粉742添加量为3 个最显著因素，进行最陡爬坡试验，确定中心点。

由表5可知，随着葡萄糖、牛肉浸粉和豆饼粉742添加量的增加，嗜酸乳杆菌LA-G80活菌密度先上升后下降，在第5组试验中达到最大，此时葡萄糖添加量为4.0%、牛肉浸粉添加量1.7%、豆饼粉742添加量0.5%。以这3 个因素添加量为中心点，以葡萄糖添加量（A）、牛肉浸粉添加量（B）、豆饼粉742添加量（C）为自变量，嗜酸乳杆菌LA-G80菌体密度（OD600nm）为响应值（Y），利用Design-Expert 8.0软件设计3因素5水平的CCD，具体数据如表6～7所示。

表5 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基成分优化最陡爬坡试验设计及结果Table5 Steepest ascent design with experimental results for optimization of medium composition for Lactobacillus acidophilus LA-G80

表6 嗜酸乳杆菌LA-G80培养基成分CCD及结果Table6 CCD with experimental results for optimization of medium composition for Lactobacillus acidophilus LA-G80

表7 响应面试验结果方差分析Table7 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

对表6的数据进行方差分析，可得拟合方程：Y=12.61＋0.37A＋1.49B＋0.52C＋0.01AB＋0.31AC-0.31BC-1.26A2-1.79B2-1.55C2。采用Design-Expert 8.0软件分析，所得模型的决定系数R2为0.933 0，校正后为0.983 0，表明此模型能解释实验中98.30%的情况。由表7可知，失拟项P值为0.059 6＞0.05，失拟项对于误差不显著，说明回归模型可信，能较好地解释嗜酸乳杆菌LA-G80菌体密度的变化，因此可利用该模型对嗜酸乳杆菌LA-G80的高密度发酵培养情况进行预测。

分析二次多项方程，利用Design Expert 8.0软件得到二维等高线和三维立体图，等高线图越接近椭圆表示交互作用越强，等高线的稀疏表示响应面图形的平陡。每个响应面三维分析图和对应的等高线图分别为当1 个变量保持0水平时，另2 个独立变量之间的交互作用。由图4～6可知：葡萄糖与牛肉浸粉、葡萄糖与豆饼粉742、牛肉浸粉与豆饼粉742对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液菌体密度的交互作用显著（P＜0.05）；在一定范围内，随着葡萄糖、牛肉浸粉和豆饼粉742添加量的增加，发酵液菌体密度随之增加，在达到一定程度后，各因素添加量继续增加，发酵液菌体密度逐渐减小，说明它们之间对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液菌体密度的影响不是简单的线性关系，只有在3 个因素添加量适宜的条件下，嗜酸乳杆菌LA-G80的发酵液菌体密度才会达到最大值。采用响应面法优化得到培养基主成分最佳添加量为葡萄糖41.5 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、豆饼粉7 425.48 g/L，其余培养基成分按照优化后的量进行添加；使用该模型预测的最大菌体密度（OD600nm）为13.928 2。37℃培养

图4 葡萄糖与牛肉浸粉对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液菌体密度交互作用的等高线及响应面图Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of glucose and beef extract powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

图5 葡萄糖与豆饼粉742对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液菌体密度交互作用的等高线及响应面图Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of glucose and soybean cake powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

图6 牛肉浸粉与豆饼粉742对嗜酸乳杆菌LA-G80发酵液菌体密度交互作用的等高线及响应面图Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effect of beef extract powder and soybean cake powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

12h，实际菌体密度（OD600nm）为13.75，可见该模型能够较好预测嗜酸乳杆菌LA-G80的菌体生长情况。

2.3 嗜酸乳杆菌LA-G80三角瓶培养条件优化结果

由表8可知，3 种因素的影响顺序为培养温度＞起始pH值＞接种量，最优培养条件为温度37℃、起始pH 6.0、接种量2%，在此条件下嗜酸乳杆菌LA-G80活菌数达到19.9×108CFU/mL。

表8 嗜酸乳杆菌LA-G80三角瓶培养条件优化设计及结果Table8 Experimental design with results for optimization of shake flask culture conditions for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.4 5 L发酵罐发酵实验结果

嗜酸乳杆菌LA-G80高密度培养过程中，不适宜的pH值会抑制酶活性，适宜的恒定pH值可以延长对数生长期、减轻过酸抑制作用、提高菌体密度，从而增加菌泥产量。在5 L罐发酵过程中，保持恒定pH 5.5，配制MRS培养基及优化培养基，在5 L罐中按照相同的培养条件培养嗜酸乳杆菌LA-G80。结果表明，利用优化后的培养基培养，嗜酸乳杆菌LA-G80在5 L发酵罐中的发酵液活菌数可达42.2×108CFU/mL，约为MRS培养基的10 倍。

3 结 论

近年来，随着人们生活水平的提高，对食品及保健品的需要越来越强烈，而嗜酸乳杆菌作为人体肠道菌群中主要的有益菌株[17-18]，对其研究也较多。嗜酸乳杆菌对于维持肠道菌群平衡[19]、保持肠道健康具有明显作用[20-21]，因此生产出具有高生物活性的嗜酸乳杆菌产品变得更加重要。本研究采用正交试验设计、中心组合试验设计和响应面分析相结合的方法，确定嗜酸乳杆菌LA-G80高密度培养过程中最显著影响因子的最佳添加量，为其高质量、高密度培养提供了一定参考。

嗜酸乳杆菌LA-G80高密度培养过程中的最优培养基组成为葡萄糖添加量41.5 g/L、麦芽糖20 g/L、大豆低聚糖10 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨15 g/L、吐温-80 1 mL/L、K2HPO4·7H2O 2 g/L、N a A c·3 H2O 5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、MnSO·4H2O 0.05 g/L、天冬氨酸0.16 g/L、丙氨酸0.16 g/L、丝氨酸0.16 g/L、花生蛋白粉5 425 g/L、豆饼粉7 425.48 g/L。嗜酸乳杆菌LA-G80的较适培养条件为接种量2%、初始pH 6.0、恒定pH 5.5、恒温37℃。进行5 L发酵罐验证实验，结果表明，菌体形态均一，发酵液活菌数最高达42.2×108CFU/mL，约为MRS培养基的10 倍。利用优化后的培养基组成及培养条件进行多次1 t发酵罐实验，结果表明，发酵液活菌数比当前生产水平提高1 倍，冻干粉活菌数和产量均提高50%以上，产品具有更高的生物活性。合理的培养基构成及粗料的使用使得培养基中营养更加均衡、营养成分更加丰富，且粗料可促进细胞分裂，有利于生产出具有高生物活性的菌粉，且菌粉的食用及保健价值更高，能够降低成本，提高效益。