原料乳中菌落总数的测量不确定度评定

崔 妍，许传鹏，齐 欣，徐文英，闫平平，田 卓，王 煜

（1.大连出入境检验检疫局检验检疫技术中心，辽宁 大连 116600；2.中检（大连）测试技术有限公司，辽宁 大连 116600）

菌落总数是食品检样经过处理、在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后所得每克（毫升）检样中形成的微生物菌落总数[1]。菌落总数测定常用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

原料乳营养丰富，适宜人类食用，但其较高的水分含量和接近中性的pH值也非常适合细菌、霉菌和酵母菌等各类微生物的生长和繁殖[2]，这些微生物的存在有的可以使乳及乳制品产生理想风味，有的则会引起乳及乳制品腐败变质，从而导致人类患病[3-5]。因此，监测原料乳的微生物指标至关重要。GB 19301—2010《食品安全国家标准 生乳》[6]对原料乳的菌落总数做出要求，其限量为2×106CFU/g（mL），而菌落总数检测结果的分散性给原料乳微生物限量的判定带来了一定困难，为乳制品生产加工企业的食品质量安全管理尤其是源头管理带来了挑战。

目前，国际上普遍使用CNAS-CL01《检测和校准实验室能力认可准则（ISO/IEC 17025:2017）》[7]对实验室的管理和技术能力进行规范要求，2018版的认可准则中指出，适当时，尤其是涉及结果符合性判定时，应对测量结果进行不确定度评定。CNAS-CL01-A001《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》[8]也规定了在微生物检测领域，某些情况下，考虑到对于检测结果的重要性，需要列出各主要的不确定度分量，并作出合理评估。

对菌落总数检测结果进行不确定度评定是实验室内部质量控制的一部分，对提供准确可靠的数据及由数据得出的符合性判定具有重要意义。本研究通过检测10 份原料乳的菌落总数，按照CNAS-CL01-G003《测量不确定度的要求》[9]和GB/T 27418—2017《测量不确定度评定和表示》[10]分析检测结果中不确定度的来源，并对检测结果进行不确定度评定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从某乳品企业抽取10 批次新鲜原料乳。

平板计数琼脂 北京陆桥技术股份有限公司；磷酸二氢钾（分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KMF 7.2（E5.2）恒温恒湿培养箱（控温范围0～70℃）德国Binder公司；400SW拍击式均质器法国Interscience公司；CL-40M高压蒸汽灭菌锅 日本Alp公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落总数检测

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[1]，无菌取样25 mL，置于225 mL磷酸盐缓冲液中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液；再用1 mL微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注入盛有9 mL稀释液的无菌试管中，混合均匀，制成1∶100的样品匀液；按上述操作，选择2～3 个适宜稀释度的样品匀液，制备10 倍系列稀释样品匀液，每个稀释度做2 个平皿，同时分别吸取1 mL空白稀释液加入2 个无菌平皿作为空白对照；及时将15～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀；待琼脂凝固后，将平板翻转，置于（36±1）℃条件下培养（48±2）h；培养结束后，计算菌落总数。

1.3.2 不确定度评定方法

参照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[11]评定合并标准偏差和标准不确定度，对测试过程产生的不确定度分量进行评估，从而评定其不确定度。

1.3.3 测定模型和不确定度来源分析

1.3.3.1 测定模型

菌落总数按公式（1）[12]计算。

式中：Y为单次测定的菌落总数/（CFU/mL）；F为样品的稀释倍数；N为1 mL样品稀释液中的菌落数/（CFU/mL）；V为样品稀释液的体积/mL。

1.3.3.2 不确定度分量确认

测量不确定度一般由若干分量组成，其中，对在规定测量条件下测得的量值用统计分析方法进行的测量不确定度分量评定称为测量不确定度的A类评定，用不同于测量不确定度A类评定的方法对测量不确定度分量进行的评定称为测量不确定度的B类评定。本研究将样品称量、样品移液和样品稀释等过程作为测量不确定度的B类评定分量进行评定。

2 结果与分析

2.1 样品制备过程引入的不确定度

2.1.1 样品称量引入的不确定度

在样品制备过程中，将25 mL样品加入225 mL磷酸盐缓冲溶液制得体积比1∶10的初始稀释液。使用25 mL和250 mL量筒量取，根据JJG196—2006《常用玻璃量器》[13]中的规定，25 mL量入式量筒的容量允差绝对值为0.25 mL，250 mL量入式量筒的容量允差绝对值为1.0 mL，按照三角分布考虑，包含因子则量取25 mL样品时，B类标准不确定度uB（V1）、相对标准不确定度urel（V1）按式（2）～（3）计算。

量取225 mL磷酸盐缓冲溶液时，B类标准不确定度uB（V2）、相对标准不确定度urel（V2）按式（4）～（5）计算。

2.1.2 样品稀释过程中引入的不确定度

将体积比1∶10的样品初始稀释液逐级稀释，得到体积比依次为1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107的样品匀液。稀释过程使用移液器移取1 mL和9 mL各级稀释样品匀液，按照JJG 646—2006《移液器》[14]的要求，均有相应的容量允许误差绝对值，本研究使用的移液器均符合标准要求，查询移液器的校准证书，按照三角分布考虑由此估算样品稀释过程中B类标准不确定度uB（d）和相对标准不确定度urel（d），结果如表1所示。

表1 样品匀液逐级稀释过程中量具校准引起的标准不确定度uB（ d）和相对标准不确定度urel（ d）Table1 Standard uncertainty uB( d)and relative standard uncertainty urel( d)caused by gauge calibration during successive dilution

不同的检测结果，样品逐级稀释的程度不同，得到的相对标准不确定度不同。

以样品1为例，样品最终稀释体积比为1∶107，根据样品称量引入的不确定度urel（V1）、urel（V2）和表1逐级稀释过程中量具校准引起的相对标准不确定度urel（d）计算，样品1稀释过程中引入的urel（d）如式（6）所示。

以样品2为例，样品最终稀释体积比为1∶104，样品2逐级稀释过程引入的相对标准不确定度urel（d）如式（7）所示。

2.1.3 加样体积的不确定度

加样体积为1 mL，本研究使用的移液器符合JJG 646—2006《移液器》[14]的要求，查询得到，移液器校准证书上的容量允许误差绝对值为0.8%，即0.008 mL，按照三角分布考虑则B类标准不确定度uB（V3）、相对标准不确定度urel（V3）分别按式（8）～（9）计算。

2.1.4 菌落总数测定的相对标准不确定度

菌落总数的相对标准不确定度urel（T）由样品逐级稀释引起的相对标准不确定度urel（d）和加样体积引入的相对标准不确定度urel（V3）组成。

以样品1为例，菌落总数测定的相对标准不确定度urel（T）如式（10）所示。

以样品2为例，菌落总数测定的相对标准不确定度urel（T）如式（11）所示。

2.2 样品菌落总数测定时引入的标准不确定度

表2 10 个样品菌落总数的测定结果Table2 Summary of results obtained for the determination of aerobic plate count in 10 samples

对10 个样品进行菌落总数测定，每个样品做2 个平行样。由表2可知，从测定结果分析，计算得出的测定结果相差极大，直接用测定结果得到标准偏差来评定不确定度的方法并不合理，因此将测定结果取对数值[15-17]，评定其合并样本标准偏差[18-19]，并计算A类标准不确定度。合并样本标准偏差按式（12）计算。

式中：Sp为合并样本标准偏差；m为样品数量；n为平行样数量。

因样品进行2 次平行实验，所以样品菌落总数测定时的A类标准不确定度uA（）如式（13）所示。

2.3 合成标准不确定度

合成标准不确定度uc（Y）由标准不确定度uA（）和相对标准不确定度urel（T）合并按式（14）计算。

在95%的包含概率下，包含因子k=2，则扩展不确定度为u=kuc（Y）=2uc（Y），根据lgxj计算每个样品的菌落总数范围，结果如表3所示。

表3 10 个样品菌落总数测定的不确定度及菌落总数范围Table3 Measurement uncertainty and aerobic plate count ranges of 10 samples

3 讨 论

3.1 菌落总数测定不确定度评定的重要性

菌落总数用于判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，在一定程度上标志着食品在生产过程中是否符合卫生要求，是原料乳重要的微生物控制指标。不确定度是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[11]，在测试过程中，对于测试结果在限量标准附近的样品进行符合性评价时，应根据CNAS-GL015《声明检测或校准结果及与规范符合性的指南》[20]进行评价。从本研究的结果可以看出，若不考虑不确定度对测定结果的影响，样品4为合格样品，而考虑不确定度后，则只有在包含概率＜95%时，才能判定样品合格。由此可见，测量不确定度的评定可以使实验室提供的数据更具有效性、科学性、公正性和可靠性。

3.2 不确定度评定数学模型的建立

在化学检测分析中主要以定量检测为主，且待测样品的化学物质具有均一性，化学领域测量不确定度评定的方法研究较为成熟，如CNAS-GL006《化学分析中不确定度的评估指南》[21]对化学检测的不确定度评定作出详细的规范要求，而微生物检测测定的是活的物质，样品的代表性差、微生物分布不均及不同菌落间的互生或拮抗等相互作用给微生物检测带来很多不确定性，这些都为微生物检测测量不确定度评定带来困难[22-23]。一些评定使用Y=X的数学模型[24-26]，没有考虑到稀释过程和体积对菌落总数测定不确定度的影响，显然缺乏合理性。本研究将对菌落总数不确定度评定有主要影响的3 个分量（F、N、V）建立数学模型，对不同批次、同一类型样品进行不确定度评定。今后，可将菌落生长率、计数误差、样品的不稳定性等分量加入数学模型，对菌落总数不确定度评定进行深入讨论。

3.3 计算公式的选择

如果是对同一样品进行多次测量来评定不确定度，可以直接使用贝塞尔公式[27-29]，但此方法较为费工耗材，不适用于日常检测。日常检测时多为不同样品，其菌落总数测定结果发散性较大，可以将检测结果取对数后计算合并样本标准偏差，评定不确定度[30-33]。本研究讨论的是不同批次的同一类型样品，当评定不同类型样品时，需要考虑样品种类和性质不同带来的差异。日常检测工作中，在标准操作规程和同等检测环境下，将种类相同或相似的样品分类并进行不确定度评定，可随时按类别将新的测定结果输入合并计算评定，对测试样品进行符合性评价。

3.4 其他不确定度分量

在微生物检测中，除了本研究的不确定度分量外，还有样品的采集、均质、培养基的制备等不确定度分量，而这些不确定度分量不便于计算且对总不确定度的贡献较小，因此本研究在评定中不予考虑，对于这些不确定度分量可以通过制定作业指导书来统一规范人员操作，从而最大程度减少由此带来的不确定度。

4 结 论

测量不确定度表示测试结果在包含概率下的分布区间，是衡量测试结果准确性和可靠性的重要参数。测量不确定度的评定有利于检测人员分析测试结果与真值的差距，了解测量水平。由于微生物的特性，食品安全法中规定微生物检验不能复检，而菌落总数的测试结果是衡量产品质量是否合格的重要依据，当测试结果接近限量标准时，为了使测试结果客观准确，需要对测试结果进行测量不确定度评定，避免各方因测量条件的不同对测试结果引起争议，有效降低检测风险并保证食品安全。