高效液相色谱法检测婴幼儿配方乳粉中酪蛋白磷酸肽

魏 敏，李兴佳，柴艳兵，李 飞，刘 丽，张耀广*

（石家庄君乐宝乳业有限公司，农业农村部乳品质量安全控制重点实验室，河北 石家庄 050021）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）是酪蛋白经适合的蛋白酶消化所得的一系列含有磷酸丝氨酸簇的短肽[1]。大量研究表明，CPP可以提高繁殖能力、降低肿瘤发生率、增强免疫力等[2-5]。因此，越来越多的保健食品、婴幼儿配方乳粉配方将CPP作为营养强化剂进行添加[6-8]。

我国对于婴幼儿配方乳粉中CPP含量的测定尚无公开、统一的方法和标准[9-12]。目前，研究较多的检测方法有毛细管区带电泳法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13-14]和液相色谱-质谱联用法[15-17]。由于毛细管区带电泳法操作复杂，液相色谱-质谱联用法价格昂贵，HPLC已逐渐成为检测CPP的主要方法[18-20]。目前，HPLC检测方法前处理复杂，本研究通过优化样品前处理方法和上机检测条件，旨在建立一种前处理简单、快速、回收率稳定的婴幼儿配方乳粉中CPP含量的HPLC检测方法，为相关标准的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CPP原料（纯度89.5%）丹麦Arla公司；婴幼儿配方乳粉7个不同品牌市售。

乙腈（色谱纯）德国默克公司；三氟乙酸（色谱纯）、盐酸（分析纯）天津市大茂化学试剂厂；实验用水为符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪美国Waters公司；BS224S电子天平瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取CPP 0.050 0 g（CPP原料纯度89.5%，折算后称取CPP原料0.055 9 g），用水定容至50 mL，配制成CPP质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液；分别准确吸取5、10、20、40、60、80、100 μL上述标准储备液，用水定容至1 mL，配制成CPP质量浓度分别为5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的标准工作液。

1.3.2 样品溶液的制备

准确称取5.00 g乳粉置于三角瓶中，用25 mL水搅拌溶解，用1 mol/L盐酸调节pH值至4.6后用水转移至50 mL容量瓶，定容，振荡摇匀，用滤纸过滤，经0.45 μm滤膜过滤后作为待测液。

1.3.3 CPP特征峰的确定

将CPP原料、不含CPP的配方乳粉及强化CPP配方乳粉作为样品，分别进行HPLC分析，通过比较确定CPP的特征峰。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流动相：A相为0.05%三氟乙酸，B相为0.05%乙腈（或A相为0.05%冰乙酸，B相为0.05%乙腈）；流速1 mL/min；柱温55℃；检测波长215 nm；进样量20.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradient elution procedure

1.3.5 CPP含量计算

样品中CPP含量按下式计算。

式中：X为样品中CPP含量/（mg/100 g）；ρ为由标准曲线计算所得试样中CPP的质量浓度/（μg/mL）；V为试样定容体积/mL；m为样品质量/g。计算结果保留3 位有效数字。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

表2 样品前处理方法Table2 Sample pretreatments

表3 经不同前处理样品的回收率及相对标准偏差Table3 Recovery and relative standard deviation for different pretreated samples

分别考察3 种样品前处理方法（表2）的准确度和精密度。由表3可知，前处理方法1的加标回收率为69.93%～89.47%，RSD为5.77%～16.30%，前处理方法2的加标回收率为86.07%～91.77%，RSD为5.29%～13.90%，前处理方法3的加标回收率为94.50%～95.45%，RSD为4.54%～7.47%。结果表明，前处理方法3的准确度和精密度最高，且操作最简单、方便。

2.2 流动相的优化

图1 0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作为流动相的HPLC图Fig.1 HPLC profile with 0.05% TFA-0.05% acetonitrile as mobile phase

图2 0.05%冰乙酸-0.05%乙腈作为流动相的HPLC图Fig.2 HPLC profile with 0.05% glacial acetic acid-0.05% acetonitrile as mobile phase

分别考察采用0.05%冰乙酸-0.05%乙腈和0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作为流动相体系时CPP的分离效果。由图1～2可知，0.05%冰乙酸-0.05%乙腈作为流动相体系时，杂峰多且不易判定，0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作为流动相体系时峰形较好，分离度高，无拖尾现象。综合分离效果、响应强度、保留时间及系统稳定性，最终选择0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作为流动相体系。

2.3 CPP特征峰的确定

由图3可知，CPP标准品和添加CPP的配方乳粉均在17.059 min出峰，而不添加CPP的配方乳粉在17.059 min处无色谱峰，因此可以确定该峰为定量检测CPP的标志峰。

图3 CPP加标样品、空白样品及标准溶液的HPLC图Fig.3 HPLC profiles of spiked sample,blank sample and standard solution

2.4 方法的线性范围、检出限和定量限

按照确定好的样品前处理条件和色谱条件对标准工作溶液进行测定，以CPP质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制CPP的标准曲线。结果表明，CPP质量浓度在5～100 μg/mL范围内时线性关系良好，标准曲线方程为y=1.26×103x＋2.95×103（R2=0.999 8）。以信噪比（RS/N）=3结合空白基质噪音响应确定方法的检出限为2 mg/100 g，以RS/N=10确定方法的定量限为5 mg/100 g。

2.5 实际样品测定

表4 实际样品测定结果Table4 Analytical results of actual samples

收集7 个品牌的市售婴幼儿配方乳粉，对产品中的CPP含量进行检测。由表4可知，本研究建立的方法能够检测出乳粉中是否含有CPP，并能够准确测定乳粉中CPP的含量。因此，该方法可用于婴幼儿配方乳粉中CPP的定量测定。

3 结 论

建立一种HPLC法检测婴幼儿配方乳粉中CPP含量的方法。以CPP标准品建立标准曲线，并对样品前处理方法和色谱条件进行优化，选择最优条件进行检测。结果表明：最优前处理条件为用盐酸（1 mol/L）调节样品溶液pH 4.6后用水转移至50 mL容量瓶中，用滤纸过滤后作为待测液；上机检测时用0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作为流动相体系进行梯度洗脱；样品加标回收率为94.50%～95.45%，线性良好（R2=0.999 8），方法检出限为2.0 mg/100 g，定量限为5.0 mg/100 g。该方法样品前处理简单、稳定性、可靠性好，检测结果满足线性、精密度、准确度及检出限要求，可用于婴幼儿配方乳粉中CPP含量的测定，为相关检测标准的出台提供了理论依据和技术支撑。