西藏灵菇中Lactobacillus casei LC577的分离鉴定及特性

齐世华，张 栋，赵林森，艾连中，王世杰,4,*

（1.河北一然生物科技有限公司，河北 石家庄 050800；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，河北 石家庄 050221；3.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；4.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

西藏灵菇，又称藏灵菇、天山灵菇、雪莲菌，是源于西藏林芝地区的菌类复合体，是多种菌共生形成的有机、统一整体，是一种传统酸乳的天然发酵剂[1]。坚持饮用西藏灵菇发酵酸乳可以增强人体抵抗力[2-3]、调节免疫[4-5]、抗衰老[6-7]、抑制有害菌生长[8]等。

近年来，随着生活水平的逐步提高，消费者对于食品的营养健康诉求逐渐加强。乳酸菌作为益生菌的主要来源，其功能性越来越受到消费者的认可，其主要作用包括调节肠道菌群平衡[9]、抗氧化[10]、降胆固醇[11]、降血压[12]、调节免疫[13]及抗肿瘤[14]等。由于我国益生菌研究起步较晚，目前市场上的益生菌主要为国外引进的菌种，开发具有我国自主知识产权的益生菌迫在眉睫。西藏灵菇是以耐热可鲁维酵母、亚罗可鲁维酵母为主体真菌，以乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌和乳酸链球菌等乳酸菌为主体细菌构成的块状共生菌系[15]，其优良的保健功能可能与其微生物组成有关。本研究期望能够从西藏灵菇中分离得到具有优良性状的益生菌，为我国国产益生菌发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

采集自西藏当雄县当曲卡镇牧民长年自制酸乳中自然形成的西藏灵菇。采用直接取样法，样品置于预先灭菌的50 mL离心管中，标记样品号并做记录，密封4℃保存。待所有样品采集完成后带回实验室4℃保存备用。

1.1.2 培养基与试剂

10 g/100 mL脱脂乳、MRS培养基、细菌基因组提取试剂盒（DP302）天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DPX-25BS-11生化培养箱、净化工作台上海新苗医疗器械制造有限公司；CX31RTSF显微镜日本奥林巴斯公司；D-37520高速离心机赛默飞世尔科技（中国）有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；7890A气相色谱-5975C质谱联用仪美国安捷伦公司；5078HW-1数显恒温磁力搅拌器杭州仪表电机有限公司；JJ200电子天平常熟市双杰测试仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品中乳酸菌的分离纯化及保存

取1 g样品至无菌研钵，研碎后置于9 mL生理盐水中振荡混匀，梯度稀释至体积比为1∶106后，分别取10-4、10-5、10-6稀释液100 μL涂布于MRS固体培养基上，37℃厌氧培养48h；菌落形成后挑取形态特征不同的单菌落至MRS液体培养基中，37℃培养24h；通过显微镜观察，将不纯的菌株在MRS固体培养基上划线分离、纯化，37℃培养48h，反复操作至少3 次，直到镜检结果为纯的单一菌株，编号、传代[16]。

对分离、纯化后的菌株进行过氧化氢实验和革兰氏染色实验，将过氧化氢反应阴性的革兰氏阳性菌株暂定为乳酸菌，取其MRS培养液1 mL与50%灭菌甘油以体积比1∶1混合后置于-80℃冰箱保存，同时另取1 mL MRS培养液进行RNA提取。

1.3.2 分离菌株的16S rRNA序列分析

采用细菌基因组小量提取试剂盒对分离纯化后的菌株进行RNA提取。以提取的RNA为模板，以细菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）为反应引物，进行16S rRNA基因的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR扩增结束后，取扩增产物2 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增成功的样品应在1 500 bp处有清晰的扩增条带，且无明显拖尾、弥散现象。将扩增成功的样品送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行纯化、测序和拼接。

将测序得到的序列利用NCBI数据库中的BLAST进行同源性分析，将鉴定菌株与模式菌株的16S rRNA序列一起运用MEGA 4.1以邻接（Neighbor-Joining，N-J）法绘制系统发育树，进行菌相分析[17]。

1.3.3 菌株产酸曲线的绘制

取所分离菌株的甘油保存管，将菌株接种至液体MRS培养基中连续活化3 代；按体积分数3%接种量接种于蛋白质含量为3 g/100 mL的巴氏灭菌脱脂复原乳中，培养温度35℃。每隔3h记录pH值，绘制菌株产酸曲线[18]。

1.3.4 发酵乳香气分析

将活化后的菌株接种至12 g/100 mL的无菌脱脂乳中，37℃发酵72h，运用气相色谱-质谱分析其发酵香气。

顶空固相微萃取：取酸乳样品7 mL，加入1 mL饱和NaCl溶液，60℃条件下用50/30 μm二乙烯苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头顶空恒温萃取30 min，然后再将萃取头在250℃进样口热解析5 min，进样，进行气相色谱-质谱解析。

色谱条件：D B-W A X聚乙二醇色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流速1.0 mL/min；升温程序：起始温度35℃，保持6 min，然后以8℃/min升至80℃，保持2 min，再以5℃/min升至110℃，最后以10℃/min升至210℃，保持10 min；进样口温度250℃（适用于DVB/CAR/PDMS萃取头）。

质谱条件：电子轰击离子源；电子轰击能量70 eV；离子源温度230℃。

1.3.5 菌株耐酸耐胆盐实验

挑取1 接种环分离菌株，接种到MRS培养基中，37℃培养48h，取出计数；同时各取1 mL该培养基，分别加入到pH值为2.5和含3 g/L牛胆盐的MRS培养基中，37℃孵育，于孵育0、4h进行菌数测定，并计算存活率[19]。

2 结果与分析

2.1 样品中乳酸菌的分离结果

从西藏灵菇中分离得到一株过氧化氢反应阴性[20-21]、革兰氏染色阳性的疑似乳酸菌，将其命名为LC577。菌株LC577在MRS琼脂培养基上形成的菌落为圆形、边缘整齐、隆起、表面光滑、有光泽、白色、不透明，显微镜下为棒状杆菌（图1）。

图1 菌株LC577的菌落（A）及显微镜（B）形态Fig.1 Colony(A)and microscopic(B)morphology of strain LC577

2.2 分离菌株LC577的16S rRNA序列分析

图2 根据16S rRNA序列构建的菌株LC577进化树Fig.2 Evolutionary tree for LC577 constructed based on 16S rRNA sequence

将测序得到的菌株LC577的RNA序列利用NCBI中的BLAST进行同源性分析，并与乳杆菌属模式菌株以N-J法绘制系统发育树。由图2可知，菌株LC577与干酪乳杆菌模式菌株Lactobacillus caseiATCC 393T同源性最高，初步确定菌株LC577为干酪乳杆菌。

2.3 干酪乳杆菌LC577的产酸曲线

图3 干酪乳杆菌LC577的产酸曲线Fig.3 Acid production curve of Lactobacillus casei LC577

由图3可知，干酪乳杆菌LC577具有良好的产酸能力。在脱脂复原乳中发酵9h可凝乳，发酵14h时的pH值可迅速降至4.5，能避免发酵过程中的染菌风险，可满足乳品厂家对于优良干酪乳杆菌发酵性能的要求；发酵至60h时，发酵乳pH值降至3.7～3.8，也可满足乳品厂家对发酵中止时发酵乳酸度的要求。

2.4 干酪乳杆菌LC577发酵乳香气分析

由图4和表1可知，干酪乳杆菌LC577发酵乳香气物质主要由乙酸、丁酸、己酸、辛酸、苯甲酸、癸酸、乳酸等酸类物质以及少量的酮类和醇类物质构成，其中乙酸、己酸、辛酸、乳酸峰面积响应值较强，说明样品酸味、干酪味浓郁。干酪乳杆菌LC577发酵乳中丁二酮、乙偶姻含量较少，而且该2 种物质香气主要表现为奶油香气，说明干酪乳杆菌LC577发酵乳奶油香气较弱[22-24]，并且干酪乳杆菌LC577发酵乳以短链脂肪酸为主。通过以上香气分析可以判断出干酪乳杆菌LC577发酵乳香气整体上表现为酸奶酪香气。

图4 干酪乳杆菌LC577发酵乳的气相色谱-质谱图Fig.4 Gas chromatogram-mass spectrometric analysis of fermented milk with Lactobacillus casei LC577

表1 干酪乳杆菌LC577发酵乳主要风味物质的峰面积响应值及香气描述Table1 Peak area response values and aroma descriptions of mainflavor compounds in fermented milk with Lactobacillus caseiLC577

2.5 干酪乳杆菌LC577的耐酸耐胆盐实验

由表2可知，干酪乳杆菌LC577在pH 2.5的MRS培养基中孵育4h的存活率达106.06%，活菌数有所增加，在含有3 g/L胆盐的MRS培养基中培养4h存活率为13.60%，说明干酪乳杆菌LC577具有很强的耐酸能力和较强的耐胆盐能力。能否耐受酸胁迫和碱胁迫是乳酸菌能否以活菌形式到达人体肠道并发挥作用的关键指标，体外耐酸耐胆盐实验是评价益生菌耐酸耐胆盐能力的常用手段[25-26]。干酪乳杆菌LC577较强的耐酸耐胆盐能力有利于其到达肠道并发挥益生作用。

表2 干酪乳杆菌LC577的耐酸耐胆盐实验结果Table2 Acid and bile salt tolerance of Lactobacillus casei LC 577

3 结 论

近几十年来，在日本、美国及欧洲等发达国家，益生菌的概念早已深入人心。目前，日本、欧洲的功能性发酵乳酸菌饮料在乳制品市场的比例已达到80%，北美约为30%。日本主要乳制品公司均在国家支持下长期开展益生菌研究，益生菌产业发展取得显著成绩。为了降低国民健康费用支出，日本鼓励公众食用健康食品以降低患病风险，因此，对益生菌的研究投入仍在进一步增加。随着我国人民生活水平的逐渐提高，对于食品健康的需求日益增长，益生菌市场需求逐步扩大，因此开发自有知识产权的益生菌不仅符合我国市场需求，同时对于提高我国公共健康水平、降低国民健康费用支出具有重要意义。

干酪乳杆菌常见于传统发酵乳制品中，具有悠久的食用历史，属于乳杆菌属，存在于人的口腔、肠道内含物、大便及阴道中，也常常出现在乳制品、饲料及面团中。目前，已有部分干酪乳杆菌被鉴定为益生菌，如干酪乳杆菌Zhang[27-28]、干酪乳杆菌Shirota[29]和干酪乳杆菌CRL431[30]等。近年来，国内外学者对干酪乳杆菌进行的研究发现，其具有调节肠道菌群[31]、抗癌[32]等作用。

本研究通过对西藏灵菇样品进行菌株分离纯化，得到一株干酪乳杆菌LC577，进一步研究发现，其具有良好的产酸特性和发酵产香能力，适宜作为酸乳发酵剂使用，同时具有良好的耐酸耐胆盐能力，具有良好的益生菌特性，因此干酪乳杆菌LC577具有良好的应用前景。