白香丹胶囊对PMDD肝气逆证模型大鼠血清抗焦虑样作用机制研究

王 帅 郜彦鑫 张 洪 付晓杰 刘金虎 张 浩 王杰琼 宋春红

经前烦躁障碍症(premenstrual dysphoric disorder, PMDD)，是指女性月经来临前一周反复出现的一系列情感、躯体及社会人际交往方面的综合症状，具有月经来临后症状减轻月经结束后症状消失的特点，是经前期综合征(premenstrual syndrome, PMS)的严重亚型之一[1]。PMDD肝气逆证作为PMDD的主要证候之一，除具有PMDD的一般症状外，主要表现为急躁易怒、小腹坠胀、焦虑、心烦等症状，极大地影响女性的正常经期生活[2，3]。近年来，大量国内外相关研究表明，PMDD肝气逆证的发生可能与患者体内雌、孕激素及抑制性氨基酸神经递质γ-氨基丁酸的表达异常有关。实验室前期动物实验研究表明，白香丹胶囊能提高PMDD肝气逆证大鼠的行为学得分，但其作用机制尚待深入研究[4]。本研究在实验室前期行为学评价的基础上，进一步检测给药后大鼠血清中孕酮(P)、四氢孕酮(ALLO)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量变化，研究白香丹胶囊对PMDD肝气逆证模型大鼠血清中P、ALLO、GABA的影响，进一步明确白香丹胶囊对PMDD肝气逆证在血清中的具体作用机制，为临床应用及进一步的机制研究奠定基础。

材料与方法

1.实验动物:SPF级雌性健康未孕Wistar大鼠，体质量135±15g，200只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK(京)2018-0001。实验前适应性饲养7天，每天正常抓握所有大鼠，每次每只大鼠抓握时间不少于5min。饲养环境恒温23±3℃，恒湿60%±5%RH，昼夜颠倒(12h/12h)每天22:00时开灯、次日8:00时关灯，食物和水正常摄取。所有操作均在≤25lx的暗淡红色灯光下进行。

2.仪器与试剂：电子天平(ZA102R4，德国赛多利斯集团)；大鼠受孕期分析仪(MK-11，日本Muromachi)；SuperMaze动物行为分析系统(上海欣软信息科技有限公司)；大鼠高架十字迷宫实验箱体(上海欣软信息科技有限公司)；大鼠旷场实验箱体(上海欣软信息科技有限公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；青霉素(山东鲁抗医药股份有限公司；批号：140602)；白香丹胶囊(山东中医药大学天然药物实验室制；批号：20171030)；盐酸氟西汀分散片(常州四药制药有限公司；批号H20170462)；孕酮ELISA检测试剂盒(武汉华美生物科技有限公司；产品编号：C013218011)；四氢孕酮ELISA检测试剂盒(武汉伊艾博科技有限公司；产品编号：8A296J)；γ-氨基丁酸ELISA检测试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司；产品编号：GR201801-1)。

3.居住入侵法制备PMDD肝气逆证模型大鼠：(1)实验大鼠动情周期的确定：根据大鼠受孕期分析仪来判断雌性大鼠动情周期：阴道电阻值≥3Kohm的雌性大鼠处于接受期(约1天)，阴道电阻值<3Kohm的雌性大鼠处于非接受期(约3天)，动情周期规律的大鼠符合一定的规律，即一个动情周期(约4天)的电阻值变化为高、低、低、低。将连续两个动情周期(约8天)阴道电阻值变化符合上述规律的雌性大鼠作为动情周期规律大鼠。(2)居住入侵诱导实验：动情周期规律大鼠作为实验的居住鼠，动情周期不规律大鼠作为实验的入侵鼠，并对入侵鼠行双侧卵巢摘除手术，手术恢复14天，待其痊愈后，进行居住入侵诱导实验。昼夜颠倒后在14:30～17:30时大鼠处于夜间兴奋状态，因此每天实验时间均为该时间段，并在居住鼠饲养环境中进行。对居住鼠进行连续4天(一个完整动情周期)的居住入侵诱导实验。待所有居住鼠居住入侵实验结束后，采用盲法对实验过程进行评定。

4.实验动物分组及给药：居住入侵实验结束后，根据各居住鼠的行为测试得分高低排列。将得分前75%的大鼠平均分为3组，即PMDD肝气逆证模型组(Model)、白香丹胶囊干预组(BXD)和盐酸氟西汀分散片干预组(FXT)，并将得分后25%的大鼠作为空白对照组(Control)。于每日8：30时按1ml/100g灌胃给药，连续给药28天。BXD组大鼠给予白香丹胶囊，给药量为0.2g/(kg·d)；FXT组大鼠给予盐酸氟西汀分散片，给药量为2.7mg/(kg·d)；模型组及正常组大鼠给予同等体积的纯水。

5.行为学评价:行为学评价于非接受期进行，末次给药1h后进行攻击行为测试、旷场实验和高架十字迷宫实验。采用攻击行为测试来评价大鼠给药后激怒行为，采用旷场实验和高架十字迷宫实验来评价大鼠的焦虑样行为。(1)攻击行为测试:对所有的居住鼠进行4天(一个完整动情周期)的攻击行为测试，具体方法同居住入侵诱导实验。(2)旷场实验：于大鼠的夜间进行，具体方法为轻捏待测大鼠颈背部皮肤并将其置于黑色的旷场箱(规格：50cm×50cm×40cm)的中央，用Supermaze 3.0动物行为分析系统记录、跟踪待测大鼠6min内的自由活动行为。观察的指标包括总路程、中央区停留的总时间。为避免大鼠间气味的相互干扰，每只大鼠测定结束后应用乙醇将旷场箱擦拭干净后，再进行下一只老鼠的检测。(3)高架十字迷宫实验：待测大鼠跑完旷场实验后，轻捏其颈背部皮肤并将其放于十字高架迷宫的中央区，且保证大鼠头部朝向任一开臂并允许其自由探索。用Supermaze 3.0动物行为分析系统记录、跟踪大鼠5min内自由活动行为。观察的指标包括进入两开臂的次数(OE)、进入两开臂的时间(OT)、进入两封臂的次数(CE)、进入两封臂的时间(CT)。

6.取材并检测：生殖内分泌激素的测定于待测大鼠全部完成行为学评价后(确保待测大鼠此时仍处于非接受期)，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔麻醉，大鼠腹主动脉取血，血样静置30min后3500r/min离心10min，将离心后的上层血清转移至EP管中。采用ELISA法分别测定各组大鼠血清中P、ALLO、GABA的含量，操作按试剂盒说明书进行。

结 果

1.攻击行为测试:与正常组大鼠比较，模型组大鼠攻击行为明显增加(P<0.01)；与模型组大鼠比较，FXT组大鼠和BXD组大鼠的攻击行为均明显减小(P<0.01)，详见图1。

图1 各组大鼠攻击行为测试得分与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

2.旷场实验：与正常组比较，模型组大鼠总路程增加(P<0.01)，而在中央区停留的总时间减少(P<0.01)；与模型组比较，FXT组和BXD组大鼠总路程均明显减少(P<0.01)，而在中央区停留的总时间均明显增加(P<0.01)；与FXT组比较，BXD组大鼠总路程稍有增加，在中央区停留的总时间也稍有增加，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

图2 各组大鼠旷场实验得分与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

3.高架十字迷宫实验：与正常组比较，模型组大鼠进入开放臂的次数百分比和时间百分比均明显减少(P<0.01)；与模型组比较，FXT组和BXD组大鼠进入开放臂的次数百分比和时间百分比均明显增加(P<0.01)；与FXT组比较，BXD组大鼠进入开放臂的次数百分比和时间百分比均略有增加，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图 3。

4.血清中指标检测:与正常组比较，模型组大鼠血清中P水平显著下降(P<0.05)，ALLO水平显著下降(P<0.05)，GABA水平显著下降(P<0.05)；与模型组比较，FXT组和BXD组大鼠血清中P水平均显著上升(P<0.05)，ALLO水平均显著上升(P<0.05)，GABA水平显著上升(P<0.05)；与FXT组比较，BXD组大鼠血清中P水平略有上升，ALLO水平略有下降，GABA水平略有下降，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图4及表1。

图3 各组大鼠高架十字迷宫实验得分与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01

图4 各组大鼠血清指标水平与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

组别n给药量孕酮(ng/ml)四氢孕酮(ng/ml)γ-氨基丁酸(ng/ml)正常组12相等剂量47.11±3.2268.975±0.525147.11±3.226模型组12相等剂量19.56±2.359∗6.497±0.1135∗19.56±2.359∗氟西汀组122.7mg/(kg·d)34.28±2.840#8.130±0.1895#34.28±2.840#白香丹组120.2g/(kg·d)38.14±4.029#7.863±0.3330#38.14±4.029#

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

讨 论

PMDD肝气逆证作为PMDD的亚型之一，突出表现为急躁易怒、心烦、焦虑、小腹坠胀等症状，严重损害了女性的身心健康，给社会带来了沉重负担。近年来有关PMDD肝气逆证的发病机制研究逐渐深入，越来越多的研究表明该疾病的发病机制与机体某些调节激素及神经递质的水平异常有关。

大量研究发现，性激素水平改变与女性情绪密切相关[5]。PMDD与卵巢黄体分泌的孕酮关系密切[6]。乔明琦等[7]研究证实PMDD肝气逆证患者E2、P卵泡期分泌峰的低水平与黄体期分泌峰的阙如，推测其是 PMDD 肝气逆证微观机制之一，这与笔者研究结果一致，PMDD肝气逆证模型大鼠血清中P含量明显降低，药物干预后明显增加，行为学症状得以改善，血清中P含量明显增加。表明模型大鼠体内P含量的紊乱是诱发PMDD肝气逆证发生的重要机制，白香丹胶囊可以通过提高模型大鼠体内P的含量来发挥作用。ALLO作为另一类重要的神经类固醇，被认为是强效GABAA受体激动剂，其血清水平能够反映月经周期的孕酮变化[8，9]。

Schüle等[10]研究表明，减少ALLO在外周血或脑脊液水平与焦虑症、严重抑郁症、经前焦虑障碍或攻击行为密切相关，ALLO降低会诱发焦虑症状的出现，症状改善后其含量会有所增加，这与本研究结果一致，模型大鼠血清中ALLO含量呈现大致相同的变化，模型组大鼠与对照组比较，ALLO水平显著性下降，经过白香丹胶囊治疗后，其ALLO水平显著增加。也与ALLO在实验动物身上体现出麻醉和抗焦虑特性的研究一致[11，12]。但也有研究证明ALLO水平降低对个体是有益的，可能是因为ALLO在杏仁核反应中存在双峰效应有关[13]。对于PMDD患者与正常对照组ALLO血清水平存在一定差异的结论，有待于进一步研究[14]。

γ-氨基丁酸(GABA)是已知重要的抑制性神经递质，有抑制攻击性行为的作用。调查显示有攻击性倾向的人，外周血与攻击性史呈负相关[15]。研究证实，GABA可以有效抑制HPA轴功能亢进，进行负反馈调节，改善情绪障碍类疾病，当焦虑症状出现时GABA含量显著性下降[16]。本研究中模型大鼠血清中GABA含量显著性下降，给予白香丹胶囊后，血清中GABA含量明显增加，与对照组GABA水平比较，差异无统计学意义。冯玉等[17]研究证实，白香丹胶囊通过提高GABA的水平而对PMS肝气逆证大鼠血清和大脑皮质神经中枢有一定的抑制作用。可知GABA水平异常是PMDD 肝气逆证的重要病理机制，也是白香丹胶囊的重要作用靶点。

综上所述，本研究证实白香丹胶囊可提高PMDD肝气逆证模型大鼠血清中P、ALLO、GABA水平，为探究PMDD肝气逆证模型大鼠脑区发病机制的研究奠定了基础。由此推测PMDD肝气逆证的发病可能与机体中枢系统中上述指标的含量下降有关，而白香丹胶囊可以通过提升P、GABA、ALLO的水平发挥治疗作用。由于技术水平有限，本研究未能深入探讨其在脑区的水平差异，有待于在今后开展的研究中证实。